?采樣與制樣

?劃線、分離和純化

?革蘭氏染色與顯微觀察

?清洗、消毒與滅菌

1.采樣的意義

?及時(shí)掌握食品及原料的過(guò)程衛(wèi)生狀況(食品采購(gòu)、生產(chǎn)加工、儲(chǔ)存運(yùn)輸、銷售消費(fèi)等)。

?評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量。

?用于尋找及分析問(wèn)題，制定和實(shí)施控制措施。

什么叫采樣?

?采樣是指在一定質(zhì)量或數(shù)量的產(chǎn)品中，取一個(gè)或多個(gè)代表性樣品，用于微生物檢驗(yàn)的過(guò)程；

?樣品必須對(duì)取樣的整個(gè)產(chǎn)品或批量具有代表性；

?樣品的大小應(yīng)能滿足在需要時(shí)進(jìn)行重復(fù)分析的需要；

?樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室時(shí)的狀況應(yīng)能反映出取樣時(shí)產(chǎn)品的真實(shí)情況。

采樣標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)：GB 4789.2-2016 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則

2.采樣原則

2.1樣品的采集應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性的原則。

2.2采樣過(guò)程遵循無(wú)菌操作程序，防止一切可能的外來(lái)污染。

3.采樣方案

3.1根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康?、食品特點(diǎn)、批量、檢驗(yàn)方法、微生物的危害程度等確定采樣方案。

?采樣方案分為二級(jí)和三級(jí)采樣方案。二級(jí)采樣方案設(shè)有n、c和m值，三級(jí)采樣方案設(shè)有n、c、m和M值。

n:同一批次產(chǎn)品應(yīng)采集的樣品件數(shù);

c:最大可允許超出m值的樣品數(shù);

m:微生物指標(biāo)可接受水平的限量值(三級(jí)采樣方案)或最高安全限量值(二級(jí)采樣方案) ;

M:微生物指標(biāo)的最高安全限量值。

3.2采樣方案的選擇:

3.2.1 廣泛分布于食品中，具有嚴(yán)重危害或者中度健康危害的微生物(病原菌)，如沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸埃希氏菌、肉毒梭菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等執(zhí)行二級(jí)計(jì)數(shù)抽樣方案(+/-)。

3.2.2 沒(méi)有或者具低度危害的微生物(衛(wèi)生指標(biāo)菌)，或者具中度危害(擴(kuò)散限制)的微生物，如需氧微生物、嗜冷微生物、乳酸菌、酵母菌、霉菌(產(chǎn)犢霉菌除外)、大腸菌群、耐熱大腸菌群等執(zhí)行三級(jí)計(jì)數(shù)抽樣方案(數(shù)值和濃度)。

二級(jí)計(jì)數(shù)抽樣方案流程

目標(biāo)微生物以檢出/未檢出(+/-) 為指標(biāo):

?設(shè)定m值、n值和c值

?抽取n個(gè)子樣，組成試驗(yàn)樣品

?檢驗(yàn)每個(gè)子樣

接收條件:所有樣品的檢驗(yàn)結(jié)果≤m;≤c個(gè)樣品的檢驗(yàn)結(jié)果>m

拒絕條件: >c個(gè)樣品的檢驗(yàn)結(jié)果>m。

例1:乳粉中沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)為為n=5、c=0、 m=0，其中n=5即取樣5個(gè)，c=0即意味著在該批檢樣中，未檢測(cè)到沙門氏菌，則此批貨物可被接受。

三級(jí)計(jì)數(shù)抽樣方案流程

目標(biāo)微生物以計(jì)數(shù)為指標(biāo):

?設(shè)定m值、M值、n值和c值

?抽取n個(gè)子樣，組成試驗(yàn)樣品

?檢驗(yàn)每個(gè)子樣

接收條件:所有樣品的檢驗(yàn)結(jié)果≤m,≤c個(gè)樣品的檢驗(yàn)結(jié)果介于m和M之間

拒絕條件: >c個(gè)樣品的檢驗(yàn)結(jié)果介于m和M之間或任一樣品的檢驗(yàn)結(jié)果>M。

例:乳粉的細(xì)菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)n=5、c=2、 m=5*10⁴、 M=2*10⁵。 其意義是從一批產(chǎn)品中，取出5個(gè)檢樣:

接收結(jié)果: 5個(gè)子樣的值全<m或允許≤2個(gè)檢樣的菌落數(shù)在m和m值之間。

拒絕結(jié)果:如果有3個(gè)以上檢樣的菌落數(shù)是在m和M值之間或1個(gè)檢樣菌落數(shù)超過(guò)M值者。

ICMSF推薦的隨機(jī)抽樣方案

?國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)( ICMSF)所建議的隨機(jī)取樣方案是目前世界各國(guó)最為流行的取樣方案，為ICMSF推薦的取樣方案。ICMSF提出的基本取樣原則是根據(jù):

各種微生物本身對(duì)人的危害程度各有不同。

涉及健康危害水平的抽樣方案及其應(yīng)用條件ICMSF

二級(jí)和三級(jí)方案對(duì)比

?從標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)格程度看，二級(jí)取樣方案比三級(jí)取樣方案要求更嚴(yán)格。

?二級(jí)取樣方案的合格判定標(biāo)準(zhǔn)只有“是”和“否”，沒(méi)有中間帶，而三級(jí)取樣方案則有中間帶，相對(duì)寬松，這也表明三級(jí)取樣方案更注重各種微生物本身對(duì)人的危害程度.從風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的角度看，也更科學(xué)一些。

?從標(biāo)準(zhǔn)的制定來(lái)看，三級(jí)取樣方案判定合格標(biāo)準(zhǔn)的制定更需建立在科學(xué)評(píng)估的基礎(chǔ)上，手續(xù)更加繁瑣，而且在實(shí)際應(yīng)用中操作較復(fù)雜;而二級(jí)取樣方案在實(shí)際操作中則相對(duì)簡(jiǎn)單。

3.2.2采樣器具要求:

?對(duì)取樣工具和一些試劑材料應(yīng)提前準(zhǔn)備、滅菌

?開(kāi)啟容器的工具:雙層紙包裹滅菌(121℃，15min) 后，通?？稍诟稍餄崈舻沫h(huán)境中保存2個(gè)月。超過(guò)2個(gè)月后要重新滅菌。

?特殊樣品采用適當(dāng)工具。

?取樣容器:采用密封容器，最好不要使用玻璃容器，因?yàn)槠湓谶\(yùn)輸途中易破碎而造成取樣失敗。

?溫度計(jì)、標(biāo)記工具、防護(hù)用品等。

3.3各類食品的采樣方法

3.3.1預(yù)包裝食品

3.3.1.1應(yīng)采集相同批次、獨(dú)立包裝、適量件數(shù)的食品樣品，每件樣品的采樣量應(yīng)滿足微生物指標(biāo)檢驗(yàn)的要求。

3.3.1.2獨(dú)立包裝小于、等于1000g的固態(tài)食品或小于、等于1000mL的液態(tài)食品，取相同批次的包裝。

3.3.1.3獨(dú)立包裝大于1000 mL的液態(tài)食品，應(yīng)在采樣前搖動(dòng)或用無(wú)菌棒攪拌液體，使其達(dá)到均質(zhì)后采集適量樣品，放入同一個(gè)無(wú)菌采樣容器內(nèi)作為一件食品樣品;大于1000g的固態(tài)食品，應(yīng)用無(wú)菌采樣器從同一包裝的不同部位分別采取適量樣品，放入同-一個(gè) 無(wú)菌采樣容器內(nèi)作為一件食品樣品。

3.3.2散裝食品或現(xiàn)場(chǎng)制作食品

用無(wú)菌采樣工具從n個(gè)不同部位現(xiàn)場(chǎng)采集樣品，放入n個(gè)無(wú)菌采樣容器內(nèi)作為n件食品樣品。每件樣品的采樣量應(yīng)滿足微生物指標(biāo)檢驗(yàn)單位的要求。

3.4采集樣品的標(biāo)記

應(yīng)對(duì)采集的樣品進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的記錄和標(biāo)記，內(nèi)容包括采樣人、采樣地點(diǎn)、時(shí)間、樣品名稱、來(lái)源、批號(hào)、數(shù)量、保存條件等信息。

3.5采集樣品的貯存和運(yùn)輸

3.5.1應(yīng)盡快將樣品送往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

3.5.2應(yīng)在運(yùn)輸過(guò)程中保持樣品完整。

3.5.3應(yīng)在接近原有貯存溫度條件下貯存樣品，或采取必要措施防止樣品中微生物數(shù)量的變化。

制樣的一般要求:

?全部制備過(guò)程應(yīng)為無(wú)菌操作

?冷凍樣品應(yīng)在規(guī)定溫度和時(shí)間下緩化

?制樣應(yīng)充分均勻: 

液體樣品振搖混勻;粉末狀的邊取邊混;固體樣品應(yīng)從不同部位取樣，兼顧表面和深度。

?取好的樣品應(yīng)以適宜方式與稀釋液充分混勻

?盡量去除產(chǎn)品中可能存在的影響微生物指標(biāo)檢測(cè)的因素。

?劃線接種:這是最常用的接種方法。

即在固體培養(yǎng)基表面作來(lái)回直線形的移動(dòng)，就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。

劃線的目的是為了獲得單菌落，以便觀察菌落特征和挑菌純化鑒定。

劃線方式很多，例如三區(qū)劃線，四區(qū)劃線等。

?純化

如果在一個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來(lái)自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)(Pure culturte)。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過(guò)程稱為純化。

目的:得到更多的純培養(yǎng)物，同時(shí)細(xì)胞活性更好，利于生化鑒定。

注意事項(xiàng):必須挑去一個(gè)單獨(dú)的可疑菌落，并且外觀(大小、形態(tài))相同情況下，也并不代表是同一種菌。

細(xì)菌是一類比真菌更小的微生物，必須通過(guò)光學(xué)顯微鏡的油鏡或者電子顯微鏡觀察。

?革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，這種染色法是由一位丹麥醫(yī)生漢斯.克里斯蒂安革蘭( Hans Christian Gram，1853年- 1938年)于1884年所發(fā)明。

?未經(jīng)染色之細(xì)菌，由于其與周圍環(huán)境折光率差別甚小，故在顯微鏡下極難觀察。染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對(duì)比，可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，而用以分類鑒定。

1、革蘭氏染色的原理

通過(guò)結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色(實(shí)為紫中帶紅) ;

革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

染色的差異主要是由于陰性與陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的差異所引起的

2、革蘭氏染色的步驟

1)涂片固定；

2)初染:結(jié)晶紫染1分鐘，水洗；

3)媒染:加碘液覆蓋涂面染約1分鐘，水洗，用吸水紙吸去水分。

4)脫色:加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色約15-30秒，直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色。水洗。

5)復(fù)染:加蕃紅染色液，染1分鐘后，自來(lái)水沖洗。干燥，鏡檢。

3、細(xì)菌的顯微鏡檢

1）當(dāng)光線通過(guò)玻片與鏡頭之間空氣時(shí)，由于兩者密度不同，光線發(fā)生折射，降低了視野的照明度。

2）若中間加入香柏油或液體石蠟，其折光率與玻片相近，則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更清晰。

3.1油鏡使用與涂片觀察

所需材料

-普通光學(xué)顯微鏡

-香柏油或液體石蠟

-載玻片

顯微鏡觀察

①調(diào)光

②低倍鏡觀察

③高倍鏡觀察

④油鏡觀察

移開(kāi)高倍鏡→滴加香柏油/液體石蠟→ 轉(zhuǎn)換油鏡，鏡頭浸入油中→微調(diào)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋觀察物象。

常見(jiàn)細(xì)菌革蘭氏染色片:

混合菌涂片:革蘭氏陰陽(yáng)菌顏色對(duì)比明顯說(shuō)明染色技術(shù)完全掌握

消毒(disinfection) :殺滅或清除傳播媒介上病原微生物，使其達(dá)到無(wú)害化的處理。

滅菌(sterilization) :殺滅或清除傳播媒介上一切微生物的處理。

無(wú)菌室消毒一一依據(jù)GB/T 27405-2008

1、紫外線消毒

1.1 在室溫20℃-25℃時(shí)220V30W紫外燈下方垂直位置1.0m處的253.7 nm紫外線輻射強(qiáng)度應(yīng)≥70 μW/cm²,低于此值時(shí)應(yīng)更換。適當(dāng)數(shù)量的紫外燈,確保平均每立方米應(yīng)不少于1.5W。

1.2 紫外線消毒時(shí),無(wú)菌室內(nèi)應(yīng)保持清潔干燥。

1.3 在無(wú)人條件下,可采取紫外線消毒,作用時(shí)間應(yīng)≥30 min。室內(nèi)溫度<20℃或>40℃、相對(duì)濕度大于60%時(shí),應(yīng)適當(dāng)廷長(zhǎng)照射時(shí)間。

1.4用紫外線消毒物品表面時(shí),應(yīng)使照射表面受到紫外線的直接照射,且應(yīng)達(dá)到足夠的照射劑量。

1.5 人員在關(guān)閉紫外燈至少30min后方可入內(nèi)作業(yè)。

紫外線輻照能量低，穿透力弱，僅能殺滅直接照射到的微生物，因此消毒時(shí)必須使消毒部位充分暴露于紫外線。

照射劑量和時(shí)間:不同種類的微生物對(duì)紫外線的敏感性不同，用紫外線消毒時(shí)必須使用照射劑量達(dá)到殺滅目標(biāo)微生物所需的照射劑量

2、臭氧消毒

2.1封閉無(wú)菌室內(nèi),無(wú)人條件下,采用20mg/m³濃度的臭氧,作用時(shí)間應(yīng)≥30 min.消毒后室內(nèi)臭氧濃度≤0.2 mg/m³時(shí)方可入內(nèi)作業(yè)。

2.2按照GB/T 18202的規(guī)定,檢測(cè)室內(nèi)臭氧的濃度。

臭氧是一種廣譜殺菌劑，可用于水、物品表面和空氣消毒。

臭氧為強(qiáng)氧化劑，對(duì)多種物品有損壞，濃度越高對(duì)物品損害越重，可使銅片出現(xiàn)綠色銹斑、橡膠老化，變色，彈性降低，使織物漂白褪色等。使用時(shí)應(yīng)注意。

3、乳酸熏蒸消毒法

一般常規(guī)消毒，即每100m³空間用乳酸12mL，加等量水后加熱蒸發(fā)30分鐘(如:酒精燈加熱、電爐加熱等)，熏蒸完畢后繼續(xù)密閉門窗6小時(shí)。室內(nèi)相對(duì)濕度60%時(shí)，殺滅效果最好。

乳酸主要通過(guò)使菌體蛋白變性凝固而達(dá)到殺菌作用。能達(dá)到消毒效果，但腐蝕性強(qiáng)，室內(nèi)用品易受損傷，還有刺激性氣味,氣體的擴(kuò)散力弱。

臭氧消毒與乳酸消毒對(duì)室內(nèi)空氣消毒的效果探討（2003）

無(wú)菌室空氣滅菌效果檢測(cè)方法沉降法

1.無(wú)菌室空氣滅菌效果驗(yàn)證方法(沉降法)

1.1 在消毒處理后與開(kāi)展檢驗(yàn)活動(dòng)之前期間采樣。

1.2 取樣位點(diǎn)的選擇應(yīng)基于人員流量情況和做試驗(yàn)的頻率。一般情況下,無(wú)菌室面積≤30m²時(shí),從所設(shè)定的一條對(duì)角線上選取3點(diǎn)，即中心1點(diǎn),兩端各距墻1m處各取1點(diǎn)；無(wú)菌室面積≥30m²時(shí),選取東、南、西、北、中5點(diǎn),其中東點(diǎn)、南點(diǎn)、西點(diǎn)、北點(diǎn)均距墻1m。

1.3 在所選位點(diǎn),將平板計(jì)數(shù)瓊脂平板(90mm)置于距地面80cm處,開(kāi)蓋暴露15 min,然后,置于36℃土1℃恒溫箱培養(yǎng)48士1h.如果檢查某目標(biāo)菌，則可用選擇性瓊脂平板(如PDA平板)。

◆室內(nèi)若面積≤30m²,在對(duì)角線上選取3點(diǎn)；若≥30m²，選取東、南、西、北、中5點(diǎn)，以上除中心點(diǎn)外，其余點(diǎn)均須距墻1m。

◆在所選點(diǎn)放置PCA平板，需距離地面80cm處，開(kāi)蓋暴露15min, 36℃土 1℃,48h土1h。

◆若檢測(cè)霉菌、酵母菌，可使用PDA平板，相應(yīng)溫度和時(shí)間培養(yǎng)。

滅菌方式:高壓滅菌、煮沸滅菌、過(guò)濾除菌等。

注意避免過(guò)度加熱:

1.大容積(>1000mL)時(shí)容易過(guò)度加熱；

2.放置物品太多或滅菌后未及時(shí)冷卻。

平皿、工器具滅菌和設(shè)備消毒一依據(jù)GB/T 27405-2008

器具和設(shè)備

濕熱滅菌:采用高壓滅菌器,121℃滅菌20 min,適用于玻璃器皿、移液器吸頭、塑料瓶等。

干熱滅菌:采用干燥箱滅菌,160℃滅菌2h,180℃滅菌1h,適用于玻璃器,不銹鋼器具等。

液體消毒劑消毒:使用適當(dāng)濃度的自配或商業(yè)液體消毒劑(參見(jiàn)表D.1)對(duì)工作臺(tái)面、器具或設(shè)備表面進(jìn)行消毒?？砂凑誈B 15981的規(guī)定;評(píng)價(jià)自配或商業(yè)消毒劑的消毒效果;可按照ISO 18593,監(jiān)測(cè)工作臺(tái)面。器具或設(shè)備表面的酒毒效果。

?干熱滅菌法是利用干熱滅菌器內(nèi)的高熱空氣對(duì)流與介質(zhì)傳導(dǎo)進(jìn)行滅菌。

適用:耐高熱，不耐濕的物品，主要用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。

一般細(xì)菌的繁殖體，在干燥狀態(tài)80～100℃經(jīng)1小時(shí)可以被殺死，芽孢則需要160℃經(jīng)2小時(shí)殺滅。

?濕熱滅菌法是利用飽和蒸汽的濕熱在一定壓力下所釋放的潛熱殺滅病原微生物、細(xì)菌繁殖體、芽胞和病毒的方法。

適用:耐高溫、耐高濕的器械和物品的滅菌，如金屬器皿、玻璃器皿、基礎(chǔ)培養(yǎng)基等。

根據(jù)消毒劑對(duì)微生物的殺菌能力，可將消毒劑分為三類：

高效消毒劑:二氧化氯、雙氧水、戊二醛、次氯酸鈉(84消毒液)等；

中效消毒劑:有乙醇、碘伏等；

低效消毒劑:有洗必泰、新潔爾滅等。

酒精擦手前與酒精擦手后

◆紫外線表面消毒與液體消毒劑消毒效果及其評(píng)價(jià)方法，請(qǐng)參照《GB 15981-1995 消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)》。

◆高壓鍋滅菌效果評(píng)價(jià)方法:

化學(xué)指示卡:使用方便，高壓后可立即得知監(jiān)測(cè)結(jié)果

生物指示劑:準(zhǔn)確性高

壓力滅菌指示膠帶:

以醫(yī)用美紋紙為基材，涂以變色油墨作滅菌指示劑，背涂以壓敏膠而成。專用于粘貼在待滅菌物品包外，用于標(biāo)示該物品包是否已經(jīng)過(guò)壓力蒸汽滅菌處理過(guò)程，以防與未經(jīng)滅菌下理的物品包相混。