中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所郭斐課題組在 Cell Reports Methods 期刊發(fā)表了題為：Rapid and sensitive one-tube detection of mpox virus using RPA-coupled CRISPR-Cas12 assay 的研究論文。

該研究建立了一種快速精準(zhǔn)的猴痘病毒檢測方法，通過將等溫擴(kuò)增（RPA）與CRISPR-Cas12a的檢測體系聯(lián)合，可以實現(xiàn)猴痘病毒DNA在30分鐘內(nèi)的快速檢測，檢測靈敏度1個拷貝數(shù)，同時能夠精準(zhǔn)區(qū)分其他正痘病毒以及猴痘病毒，具有良好的實用價值。

研究團(tuán)隊首先設(shè)計了兩個crRNA的檢測體系池，其中一組靶向正痘病毒（包括痘苗病毒、天花、牛痘以及猴痘）的保守區(qū)D6R和E9L，可以檢測所有的正痘病毒；另外一組靶向猴痘病毒特有的區(qū)域N3R和N4R。通過對crRNA的設(shè)計和篩選，建立了基于CRISPR/Cas12a的熒光報告體系（圖1）。

圖1：CRISPR-Cas12a檢測體系的建立及crRNA的篩選

進(jìn)一步針對選擇的crRNA，分別檢測不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒模板以及病毒DNA模板，觀察到CRISPR-Cas12a單獨檢測體系的檢測限約為108拷貝數(shù)，不同crRNA的聯(lián)合可以將檢測限提高到107拷貝數(shù)，同時實現(xiàn)了正痘病毒與猴痘病毒的區(qū)分。并且為了實現(xiàn)最低檢測限，研究團(tuán)隊團(tuán)隊將等溫擴(kuò)增（RPA）與CRISPR-Cas12a的檢測體系聯(lián)合，最終能夠達(dá)到1個拷貝的最低檢測限，大大提高了檢測體系的靈敏度（圖2）。

圖2：RPA聯(lián)合CRISPR-Cas12a檢測體系的實現(xiàn)1個拷貝的最低檢測限

為了驗證檢測體系實際應(yīng)用的可靠性與準(zhǔn)確性，針對中國大陸第一例猴痘病例的拭子樣本進(jìn)行了檢測。該體系同樣實現(xiàn)了1個拷貝數(shù)的最低檢測限，并且成功的在病人咽拭子，鼻拭子以及水泡拭子中檢測到了猴痘病毒的DNA，證實了體系應(yīng)用的可靠性。同時針對猴痘病毒核酸檢測試劑國家參考品的檢測，陰性參考品中未檢測到猴痘病毒的DNA，進(jìn)一步證實了檢測體系的準(zhǔn)確性（圖3）。

圖3：RPA聯(lián)合CRISPR/Cas12a檢測體系對臨床樣本的檢測

最終為了提高檢測效率，進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)體系到單管中，大大的縮短了檢測時間以及操作步驟。在提取得到待測DNA后，15分鐘到30分鐘內(nèi)即可實現(xiàn)樣本的快速檢測，且靈敏度高達(dá)1個拷貝數(shù)。相比于傳統(tǒng)熒光PCR的2小時，大大縮短了檢測時間，提高了檢測的靈敏度（圖4）。

圖4：RPA聯(lián)合CRISPR-Cas12a檢測體系的優(yōu)化

綜上所述，該研究建立了猴痘病毒的快速精準(zhǔn)的檢測方法，通過crRNA的篩選建立了一套CRISPR檢測體系，并聯(lián)合等溫擴(kuò)增實現(xiàn)了猴痘病毒的快速、靈敏的精準(zhǔn)檢測。為猴痘病毒的快速診斷提供了有力的技術(shù)支持。

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所助理研究員趙斐、博士生胡亞美、范張玲，中國疾病預(yù)防控制中心黃保英為論文共同第一作者。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所郭斐研究員、中國疾病預(yù)防控制中心譚文杰研究員和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所許豐雯副研究員為論文共同通訊作者，感謝合作者加拿大麥吉爾大學(xué)梁臣教授、北京同仁醫(yī)院房居高教授、北艾斌教授的大力支持。該研究獲得了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新工程、科技部國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金等項目的資助。