CRISPR-Cas9全RNA體系的基因編輯實驗Protocol及T7E1酶切效率檢測方法

生物_醫(yī)藥_科研 2019-08-23

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我們知道，RNAi是從mRNA水平對目的基因進行沉默，而CRISPR-Cas9是從基因組水平對目的基因進行敲除或消除目的基因在細胞內(nèi)的表達，讓靶蛋白的功能下調(diào)或完全喪失，Cas9靶點的選擇范圍相比RNAi也更加廣泛，包括所有基因組序列，如外顯子、內(nèi)含子、啟動子、增強子、基因間隔序列等。

2019年國家自然科學基金以CRISPR為關(guān)鍵詞的項目資助金額達到3485萬元，伴隨CRISPR體系的不斷優(yōu)化與應(yīng)用深入，CRISPR-Cas9也逐漸成為越來越普遍的基因功能研究工具并進入更多實驗室。

CRISPR-Cas9與RNAi的區(qū)別

在眾多CRISPR-Cas9工具中，全RNA體系的CRISPR-Cas9基因編輯工具由于不需要構(gòu)建質(zhì)粒或包病毒載體，一次可以同時靶向更多的目的基因，毒性小，操作難度大大降低，準備工作更少，周期更短，同時性價比更高，實驗環(huán)境更加友好，極大地降低了基因編輯技術(shù)的門檻、降低了操作實驗難度并提高了實驗的成功率。

今天小編就以銳博生物的基因編輯專利體系（中國專利號：108977442A；PCT申請?zhí)枺篊N2018/088105），為大家詳細介紹全RNA體系的riboEDIT? CRISPR-Cas9具體操作流程與T7E1編輯效率檢測的實驗方法，希望對即將進行基因敲除、瞬時基因表達、構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株或動物胚胎干細胞等實驗的小伙伴提供更加簡單有效的實驗途徑！如果您的目的基因很難沉默或敲降、編輯效率低、脫靶嚴重或操作復雜難度過大，以及不愿冒險從事病毒類實驗操作，不妨嘗試這一高性價比的全RNA體系！

運輸保存

低溫運輸：riboEDIT Cas9 mRNA，riboEDIT T7EI Enzyme（液態(tài)儲存）、riboEDIT tracrRNA、riboEDIT crRNA、riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set（陽性對照為凍干粉形式，上下游引物為液態(tài)存儲）等組分為干冰運輸，riboFECT mRNA Transfection Reagent 為4°C冰袋運輸。

保存方式：-20 °C 低溫凍存，避免反復凍融，長期請置于-80℃保存，實驗過程置于冰上放置，使用完畢后請于-20℃~-80℃小心保存。

CRISPR-Cas9全RNA體系操作方法

因不存在DNA插入的風險，riboEDIT? CRISPR-Cas9全RNA體系是一種更安全的基因編輯工具并已申請專利。riboEDIT Cas9 mRNA是體外轉(zhuǎn)錄生成的Cas9 mRNA，具有帽子和polyA尾巴結(jié)構(gòu)，編碼序列采用人源密碼子優(yōu)化的S. pyogenes Cas9，帶有核定位信號（NLS），C端的一個1XFLAG標簽，5’非翻譯區(qū) (5’UTR)及3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，以促進mRNA的翻譯和提高mRNA的穩(wěn)定性，與經(jīng)優(yōu)化的crRNA和tracrRNA共同使用，適用于高效率的哺乳動物細胞的基因編輯，是相比載體或慢病毒體系具有諸多優(yōu)勢。

實驗準備（以轉(zhuǎn)染24孔板為例）

(1) 將riboEDIT tracrRNA（5nmol）和riboEDIT crRNA（5nmol）分別加入250μL RNase-free H2O，各自稀釋至20μM，作為儲存溶液。使用前，用RNase-free H2O進一步稀釋至10μM，置于冰上備用。注：riboEDIT tracrRNA和riboEDIT crRNA可根據(jù)具體實驗體系稀釋至合適的濃度使用。

(2) riboEDIT Cas9 mRNA（500ng/μL），置于冰上備用。

實驗步驟

(1) 準備細胞：轉(zhuǎn)染前18-24h，取對數(shù)生長期細胞接種于24孔板中，實驗前細胞密度達到50%~70%為宜。

(2) 取一支1.5mL EP管，加入25μL Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，再加入2μL riboFECT mRNA Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育10min。（不建議加雙抗）

(3) 另取一支1.5mL EP管，加入25μL Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基，然后加入2μL riboEDIT Cas9 mRNA（500ng/μL）。

(4) 然后加入1μL tracrRNA（10μM）和1μL crRNA（10μM），crRNA和tracrRNA按1:1加入。不同孔板轉(zhuǎn)染體系可按照表1自行優(yōu)化。

(5)將crRNA、tracrRNA、Cas9 mRNA混合物加入到稀釋的轉(zhuǎn)染試劑中，室溫孵育5min。

(6)孵育結(jié)束后，將上述制備好的轉(zhuǎn)染復合物加入到細胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)48~72h。

(7)提取基因組，使用riboEDIT T7EI Enzyme進行基因編輯效率檢測。

表1. riboEDIT? Cas9 mRNA轉(zhuǎn)染體系

* 轉(zhuǎn)染體系需確保轉(zhuǎn)染總量(pmol)，pmol/μM=加入的體積

* 請保證crRNA和tracrRNA按1:1加入

T7E1酶切檢測靶位點編輯效率

操作說明

在細胞轉(zhuǎn)染后，建議使用T7E1酶切法篩選編輯效率高的crRNA進行下游實驗。

實驗步驟

（1）提取基因組：細胞轉(zhuǎn)染后48-72h后，收集細胞抽提基因組，并用微量紫外分光光度計定量。

（2）PCR擴增靶基因片段：將純化得到的基因組DNA稀釋至合適的濃度范圍，吸取100ng-500ng基因組DNA用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，陽性對照組使用riboEDIT? Positive Control crRNA Validation Set的引物進行擴增，引物信息見表2。

注：基因組DNA模板用量及PCR條件需根據(jù)反應(yīng)體系自行優(yōu)化。

表2. riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set 引物序列

（3）DNA片段退火：DNA片段按照表4退火體系進行混合，充分混勻后置于PCR中運行退火程序（表4）?；?5℃加熱5min，然后自然冷卻至室溫。

表3. 退火體系

表4. DNA雙鏈退火程序

（4）T7EI酶切：退火完成后，每管加入0.5μL riboEDIT? T7EI Enzyme（10U/μL），37℃溫育30min。

（5）電泳檢測： T7E1酶切后，產(chǎn)物進行純化，然后使用2%-3%瓊脂糖凝膠電泳或Agilent 2200 Tape Station檢測酶切條帶和編輯效率。

基因編輯結(jié)果展示

MHCC97H細胞共轉(zhuǎn)染10pmol riboEDIT? crRNA、10pmol riboEDIT? tracrRNA和1ug riboEDIT? Cas9 mRNA，48小時后 riboEDIT? T7EI Enzyme酶切檢測靶位點的剪切效率，候選7個靶基因的剪切條帶及編輯效率。其中，針對7個目的基因分別設(shè)計2條crRNA，其中10條crRNA及其配套體系的編輯效率均達到50%以上，編輯效率最高的一條達到81.1%，其中Indel%表示T7E1酶切檢測的編輯效率。