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Outline
1. 基于小分子的靶向蛋白降解技術(shù) 蛋白降解靶向嵌合體（Proteolysis targeting chimeras，PROTAC）是一種有吸引力的靶向蛋白降解技術(shù)，它是具有E3泛素連接酶結(jié)合部分與感興趣蛋白(POI)結(jié)合部分連接的雙功能小分子，通過(guò)招募泛素連接酶對(duì)目的蛋白進(jìn)行泛素化實(shí)現(xiàn)靶向降解。PROTAC分子具有高效、低耐藥性等特點(diǎn)，同時(shí)能靶向“無(wú)藥可及”蛋白，其應(yīng)用前景十分廣泛。
為了增加PROTAC在設(shè)計(jì)上的選擇性，研究者們針對(duì)降解過(guò)程中形成的核心結(jié)構(gòu)— “靶蛋白-PROTAC-E3泛素連接酶”進(jìn)行了一系列的設(shè)計(jì)與優(yōu)化。近期，有多項(xiàng)研究針對(duì)現(xiàn)有的E3連接酶開(kāi)發(fā)了特異性的配體分子，其中研究者利用競(jìng)爭(zhēng)性ABPP策略鑒定到E3連接酶DCAF1的C1113位點(diǎn)可以被他們所設(shè)計(jì)的探針MY1B特異性結(jié)合，在MY1B的基礎(chǔ)上連接靶蛋白的小分子配體從而將其改造為PROTAC分子，并起到了靶向降解的作用【J. Am. Chem. Soc. | 通過(guò)親電的位點(diǎn)選擇性和立體選擇的PROTAC試劑靶向蛋白降解】。另外，也有研究人員通過(guò)高通量篩選的方法從共價(jià)配體庫(kù)中獲得E3泛素連接酶FEM1B的特異性共價(jià)反應(yīng)配體，與需要降解的靶蛋白配體連接從而進(jìn)而降解靶蛋白【J. Am. Chem. Soc. | 開(kāi)發(fā)招募E3連接酶FEM1B靶向降解的PROTAC分子】。
除了開(kāi)發(fā)E3泛素連接酶的特異性配體，靶蛋白配體的開(kāi)發(fā)也充滿挑戰(zhàn)性，尤其針對(duì)沒(méi)有小分子結(jié)合、無(wú)藥可及的靶蛋白，PROTACs技術(shù)具有一定的局限性。于是研究者提出了一種新的PROTAC方法，稱為橋接PROTAC，它利用目標(biāo)蛋白的相互作用蛋白的小分子配體將蛋白質(zhì)復(fù)合體招募到與E3泛素連接酶附近，以靶向無(wú)小分子配體可及的蛋白質(zhì)靶標(biāo)。以Cyclin D1靶蛋白為例，Cyclin D1與下游蛋白CDK4/6形成復(fù)合體，考慮到?jīng)]有報(bào)道Cyclin D1小分子配體，因此研究者利用CDK4/6小分子高效、選擇性的抑制劑設(shè)計(jì)并合成了一系列可能的橋接PROTAC分子，經(jīng)過(guò)優(yōu)化篩選發(fā)現(xiàn)MS28能有效降解Cyclin D1【J. Am. Chem. Soc. | 橋接PROTAC技術(shù)靶向降解無(wú)小分子配體可及的蛋白靶點(diǎn)】。
為了評(píng)價(jià)PROTAC分子對(duì)靶蛋白的降解能力，研究者基于時(shí)間分辨的FRET策略，發(fā)展出能快速且高通量地檢測(cè)靶蛋白和結(jié)合配體結(jié)合性能以及定量檢測(cè)內(nèi)源性蛋白含量的方法。在靶蛋白的抗體上連接FRET供體，靶蛋白抑制劑分子連接FRET供體，當(dāng)抗體和抑制劑小分子都與蛋白結(jié)合時(shí)，促使FRET信號(hào)產(chǎn)生。針對(duì)結(jié)合配體的鑒定，在含有抗體和抑制劑分子的顯色體系里，逐漸滴加細(xì)胞裂解液，觀測(cè)FRET信號(hào)變化，再添加靶蛋白結(jié)合配體競(jìng)爭(zhēng)處理，F(xiàn)RET信號(hào)減弱；針對(duì)蛋白含量的測(cè)定，在測(cè)定FRET信號(hào)前，如果PROTAC分子將蛋白降解，其FRET信號(hào)便可以直接反映內(nèi)源性靶蛋白含量。【Cell Chem. Biol. | 直接的高通量蛋白定量策略用于發(fā)現(xiàn)BRD4降解劑】。
近期的研究針對(duì)細(xì)胞中多種重要靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)了基于小分子的靶向降解劑。GPX4可以通過(guò)減少脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)保護(hù)細(xì)胞免于鐵死亡，因此通過(guò)PROTAC誘導(dǎo)GPX4的降解有可能會(huì)增加脂質(zhì)過(guò)氧化并導(dǎo)致鐵死亡，來(lái)實(shí)現(xiàn)更高效的鐵死亡誘導(dǎo)效果。研究人員首先合成了乙二醇鏈接的帶有GPX4抑制劑ML162和Pomalidomide基團(tuán)的PROTAC小分子dGPX4，結(jié)構(gòu)中的ML162部分能夠靶向GPX4，氯乙酰胺部分可以和GPX4中的硒代半胱氨酸共價(jià)結(jié)合，Pomalidomide部分招募E3鏈接酶實(shí)現(xiàn)降解，并通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)證明dGPX4誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡的策略具有通用性。【Angew. Chem. Int. Ed.｜設(shè)計(jì)GPX4的PROTAC降解劑以誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡】。
富亮氨酸重復(fù)激酶2 (LRRK2)是治療帕金森疾病的重要靶點(diǎn)，該靶點(diǎn)的小分子抑制劑具有不同程度的脫靶效應(yīng)和毒副作用，因此PROTAC技術(shù)可作為新的替代靶向策略，研究人員通過(guò)構(gòu)建第一代和第二代化合物庫(kù)成功篩選出了具有高降解活性的PROTAC分子【J. Am. Chem. Soc.｜靶向LRRK2的PROTAC分子X(jué)L01126的發(fā)現(xiàn)】。 2. 基于大分子的靶向蛋白降解技術(shù) 在過(guò)去的二十年中，基于小分子的蛋白質(zhì)降解技術(shù)取得了重要進(jìn)展，但它們?nèi)杂形詹?、生物利用度低等缺點(diǎn)。而基于大分子的降解技術(shù)，如LYTAC 技術(shù)展示了基于大分子進(jìn)行蛋白靶向降解的潛力。最近有研究開(kāi)發(fā)了一種利用抗體同時(shí)結(jié)合細(xì)胞膜E3連接酶和跨膜蛋白，從而誘導(dǎo)靶蛋白降解的蛋白水解靶向抗體（PROTAB）技術(shù)。研究人員設(shè)計(jì)的PROTAB是一種雙抗，結(jié)構(gòu)一端靶向靶蛋白IGF1R，另一端靶向細(xì)胞膜E3連接酶（RNF43或ZNRF3的N端糖蛋白D）。將PROTAB加入表達(dá)RNF43或ZNRF3細(xì)胞中，細(xì)胞表面的IGF1R可以被有效降解【Nature | 利用抗體使E3泛素連接酶靶向降解受體】。
異曲同工地，KineTAC技術(shù)是基于完全重組的雙抗來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞表面和細(xì)胞外靶蛋白經(jīng)溶酶體降解。研究人員發(fā)現(xiàn)趨化因子CXCL12與誘餌受體CXCR7結(jié)合后會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生嵌合體內(nèi)吞?；谶@一原理將趨化因子CXCL12的N端融合到雙特異性抗體一端的Fc結(jié)構(gòu)域中，而另一端則融合感興趣的蛋白抗體，并通過(guò)Knob-Hole的蛋白設(shè)計(jì)策略在單個(gè)哺乳動(dòng)物結(jié)構(gòu)中表達(dá)雙臂，并完成雙特異性抗體KineTAC的組裝。KineTAC利用細(xì)胞因子的內(nèi)化將細(xì)胞外及細(xì)胞膜上的靶蛋白靶向溶酶體進(jìn)行降解，研究人員在PD-L1/HER2/EGRR等常見(jiàn)的膜蛋白上測(cè)試了KineTAC降解活性【Nat. Biotechnol. | 模塊化細(xì)胞因子受體用于細(xì)胞表面和細(xì)胞外蛋白的靶向降解】。
最近也有研究利用酵母展示技術(shù)篩選納米抗體來(lái)獲得靶蛋白BCL11A選擇性配體，將納米抗體融合到一個(gè)細(xì)胞滲透性的微型蛋白和E3適配器上，從而產(chǎn)生一種高效的降解劑，這項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)出的蛋白類PROTAC分子為“無(wú)配體可及”蛋白質(zhì)的靶向降解建立了一個(gè)新的范式。【ACS Cent. Sci. | 基于細(xì)胞滲透性納米抗體的蛋白誘導(dǎo)降解劑】。
3. 新型蛋白標(biāo)簽用于靶向蛋白降解策略 靶向蛋白標(biāo)簽的蛋白降解策略(tTPD)通過(guò)設(shè)計(jì)能夠結(jié)合E3泛素連接酶以及特定的蛋白標(biāo)簽的雙功能分子，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)帶有特定標(biāo)簽的蛋白的選擇性降解。近期已有多項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)了新的蛋白標(biāo)簽用于tTPD策略中。研究人員選取了商業(yè)可得的NanoLuc標(biāo)簽標(biāo)記感興趣蛋白，并將一種已知的NanoLuc抑制劑與CRBN的招募基團(tuán)沙利度胺通過(guò)linker連接，并通過(guò)優(yōu)化linker長(zhǎng)度，最終找到了效果最優(yōu)的降解劑，從而開(kāi)發(fā)了靶向NanoLuc標(biāo)簽的蛋白靶向降解策略【Nat. Commun. | 靶向熒光素酶標(biāo)簽的蛋白降解子開(kāi)發(fā)】。
在細(xì)菌等原核生物中，基于泛素標(biāo)簽降解系統(tǒng)的PROTAC技術(shù)沒(méi)有辦法使用，但是細(xì)菌內(nèi)也有一套類似的“標(biāo)簽蛋白質(zhì)降解”系統(tǒng)，只不過(guò)蛋白酶識(shí)別的不是泛素標(biāo)簽，而是磷酸化的精氨酸。ClpC:ClpP (ClpCP) 蛋白酶復(fù)合物對(duì)于微生物蛋白的降解是必須的，ClpC 部分是一個(gè) ATP 酶驅(qū)動(dòng)的去折疊酶，能夠識(shí)別結(jié)合磷酸化的精氨酸；ClpP 則扮演了蛋白酶的降解角色。因?yàn)楸狙芯渴紫仍O(shè)計(jì)了 BacPROTAC-1，包含三部分：與 ClpC 結(jié)合的 pArg，一段長(zhǎng) linker 和能夠與靶蛋白結(jié)合的小分子，通過(guò)設(shè)計(jì)的雙功能小分子，使細(xì)菌的降解系統(tǒng)識(shí)別并降解磷酸化精氨酸標(biāo)簽的蛋白。通過(guò)新型的蛋白標(biāo)簽“劫持”細(xì)菌或者支原體的 ClpCP 蛋白酶降解系統(tǒng)，開(kāi)發(fā)出了能夠在細(xì)菌內(nèi)發(fā)揮功能的 BacPROTACs，這對(duì)于后續(xù)研究人員開(kāi)發(fā)新的抗生素提供了新的思路。【Cell｜BacPROTACs 介導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)靶蛋白降解】。
4. 拓展
PROTACs將目的蛋白招募到E3連接酶附近給蛋白加上泛素化標(biāo)簽從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的蛋白酶體降解。這種異源雙功能小分子還被廣泛應(yīng)用于靶向蛋白的內(nèi)體、溶酶體水解以及磷酸化和去磷酸化，但是目前為止，還沒(méi)有一種廣譜性的小分子可以用于提高靶蛋白的穩(wěn)定性。受PROTAC的啟發(fā)，該研究開(kāi)發(fā)了一種去泛素化酶靶向嵌合體（deubiquitinase-targeting chimeras，DUBTACs）用于靶向蛋白質(zhì)穩(wěn)定（targeted protein stabilization，TPS）。作者使用ABPP技術(shù)發(fā)現(xiàn)去泛素化酶OTUB1的C23位點(diǎn)具有較高的親核性且不參與酶活性的調(diào)控，是一個(gè)比較理想的配體結(jié)合位點(diǎn)。隨后作者利用小分子庫(kù)與化學(xué)探針競(jìng)爭(zhēng)的ABPP技術(shù)找到了一個(gè)與OTUB1有較高親和力的共價(jià)配體EN523。將EN523與靶蛋白配體相連獲得異源雙功能小分子，可以有效穩(wěn)定靶蛋白【Nat. Chem. Biol. | 利用去泛素化酶靶向穩(wěn)定蛋白質(zhì)】。
現(xiàn)已開(kāi)發(fā)利用蛋白酶體或溶酶體進(jìn)行降解的工具，但對(duì)蛋白種類有局限性。有研究發(fā)現(xiàn)自噬運(yùn)載配體p62結(jié)合ATL（自噬靶標(biāo)配體），通過(guò)構(gòu)象變化將無(wú)活性的p62激活為自噬相容形式。與ATL結(jié)合后，p62暴露其PB1結(jié)構(gòu)域，與TBL（靶標(biāo)結(jié)合配體）結(jié)合，發(fā)生自聚合并暴露其LIR結(jié)構(gòu)域，與自噬膜上的LC3相互作用發(fā)生降解。在此基礎(chǔ)上，研究人員構(gòu)建了AUTOTAC平臺(tái)：首先，AUTOTAC通過(guò)TBL和ATL將靶標(biāo)結(jié)合到p62，形成三元復(fù)合物。其次，無(wú)活性的p62在結(jié)構(gòu)上被激活，自寡聚化形成靶標(biāo)-p62寡聚復(fù)合物，這是AUTOTAC的核心機(jī)制。接著，AUTOTAC通過(guò)巨自噬促進(jìn)靶標(biāo)-p62復(fù)合物的降解，該降解不依賴泛素和蛋白酶體。最后，AUTOTAC從溶酶體循環(huán)到胞質(zhì)溶膠中的其他靶標(biāo)，持續(xù)進(jìn)行降解【Nat. Commun. | 通過(guò)自噬溶酶體靶向降解蛋白質(zhì)的AUTOTAC平臺(tái)】。
本文作者：ZJ |
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