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　2021-10-14A-A+

PROTAC 本質(zhì)

PROTAC 是一種雜合雙功能小分子化合物，結構中含有兩種不同配體，一個是泛素連接酶 E3 配體，另一個是與細胞中目標靶蛋白結合的配體，兩個配體之間通過 Linker 相連，從而形成“三體”聚合物——靶蛋白配體-Linker-E3 配體。然后通過 E3 連接酶給靶蛋白加上泛素化標簽，啟動細胞內(nèi)強大的泛素化水解過程，通過泛素-蛋白酶體途徑特異性地降解靶蛋白。

PROTAC 原理

PROTAC 分子在進入細胞后，其結構中的目標蛋白（Protein of interest, POI）配體可特異性地與相應的靶蛋白結合，而另一端可以募集 E3 連接酶從而形成 POI-Linker-E3 ligase 三元復合物，其中 E3 連接酶可介導泛素結合酶 E2 對 POI 泛素化。被泛素標記的 POI 被蛋白酶體識別并降解。此過程無需靶蛋白配體長時間占據(jù)結合位點，只需三元復合物短暫的形成便可瞬時完成目標蛋白的泛素化，并且 PROTAC 在細胞內(nèi)可多次循環(huán)利用。

泛素-蛋白酶體途徑

細胞中的很多信號通路是通過泛素-蛋白酶體途徑選擇性降解某些關鍵調(diào)控蛋白來實現(xiàn)調(diào)控的。細胞內(nèi)每時每刻都有數(shù)以千計的蛋白泛素化過程在進行,這種對特定蛋白高度特異的識別機制主要是由 E3 泛素連接酶決定的。

泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome pathway, UPP）：是細胞內(nèi)蛋白降解的主要途徑，參與細胞內(nèi) 80% 以上蛋白質(zhì)的降解。泛素分子在一系列酶作用下，將細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分類，從中選出靶蛋白分子，對靶蛋白進行特異性修飾的過程，形成靶蛋白多聚泛素鏈。這些酶包括泛素激活酶（E1），泛素結合酶（E2）、泛素連結酶（E3）等。這一過程是一個三酶級聯(lián)反應。靶蛋白被泛素（多肽）標記，然后被蛋白酶體識別和降解。通過這樣一個需要消耗能量的過程，細胞以高度特異方式對不需要的蛋白進行降解。值得一提的是，泛素化過程也是可逆的，泛素可被去泛素化酶（Deubiquitinase, DUB）從泛素鏈上去除，形成反向調(diào)節(jié)。

泛素化在蛋白質(zhì)的代謝、調(diào)節(jié)和降解中起重要作用，蛋白質(zhì)泛素化是生物體內(nèi)一種常見的翻譯后修飾，同時參與細胞周期、凋亡、分化等幾乎一切生命活動的調(diào)控。泛素化與腫瘤、心血管、自身免疫等疾病的發(fā)病密切相關。

泛素分子(Ubiquitin)：是一種由 76 個氨基酸組成的小蛋白。具有高度保守的序列且存在于所有已知的真核生物體中。主要功能是標記需要分解掉的蛋白質(zhì)，使其被蛋白酶體降解。泛素鏈與蛋白底物的結合形成被蛋白酶體降解的識別信號。單獨的泛素本身并沒有任何生物功能，只是一種分子標記蛋白，發(fā)揮作用必須在 ATP 提供能量的前提下依靠泛素途徑的相關酶類及蛋白酶體。

蛋白酶體 (Proteasome)：26S 蛋白酶體是 ATP 依賴型蛋白水解復合體，由 2 個 19S 調(diào)節(jié)亞單位，1 個 20S 核心亞單位， 和 11S 調(diào)節(jié)因子構成；組成一種桶狀結構，2 個 19S 亞單位位于桶狀結構的兩端，識別多聚泛素化蛋白并使其去折疊。20S 為催化亞單位，位于兩個 19S 亞單位的中間，其活性部位處于桶狀結構的內(nèi)表面，可避免細胞環(huán)境的影響。20S 有胰蛋白酶、糜蛋白酶和谷氨酰樣肽水解活性，可以裂解大多數(shù)的肽鍵。

PROTAC相關產(chǎn)品

ARV-771 是一種通過 PROTAC 技術形成的有效 BET 降解劑。對 BRD2(1)，BRD2(2)，BRD3(1)，BRD3(2)，BRD4(1) 和 BRD4(2) 的 Kd 值分別為 34，4.7，8.3，7.6，9.6 和 7.6 nM。ARV-771 一端是泛素連接酶 E3 配體，另一端是與靶蛋白 BET 結合配體，兩個配體之間通過 linker 相連，從而使 ARV-771 特異性低降解 BET 蛋白。

dBET1由 BRD4 抑制劑JQ1（HY-13030）與Thalidomide衍生物通過 Linker 產(chǎn)生的 PROTAC。能夠在低納摩爾濃度下誘導 BRD4 降解 dBET1 顯著降低了 BRD2、BRD3 和 BRD4 水平，同時具有較小的脫靶降解效應。

BI-3663由 PTK2/FAK 抑制劑BI-4464與 Pomalidomide衍生物通過 Linker 產(chǎn)生的PROTAC。能夠在低納摩爾濃度下誘導PTK2降解。

多樣化的 E3 連接酶

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有 600 多種 E3 泛素連接酶復合體，下面介紹研究最熱的 2 種：von Hippel-Lindau (VHL) 型和 Cereblon (CRBN) 型。

Cullin蛋白

Cullin (Cul) 家族可形成調(diào)節(jié)細胞周期的活性復合體。Cullin (Cul) 家族有 6 個成員蛋白Cul1， Cul2，Cul3, Cul4, Cul5, Cul7。

N端有 Cul 重復結構 (Cul repeat, CR)

C 端有 Cul 同源區(qū) (Cul homology, CH) , Neddy8 修飾位點：轉錄后修飾。

第一種：Von Hippel-Lindau (VHL) 型 E3 泛素連接酶復合體

VHL 基因是一種抑癌基因,其蛋白產(chǎn)物 VHL 可與 ElonginB、ElonginC、Cullin2蛋白組成 VBC (VHL-ElonginB/C-CUL2) 復合物,該復合物屬于 E3-泛素蛋白酶系統(tǒng)，介導人體內(nèi)多種蛋白的降解。癌癥中 VHL 經(jīng)常發(fā)生突變，近 70% 的突變都是破環(huán)了 VHL 與Elongin 的結合。

第二種：Cereblon (CRBN)型 E3 泛素連接酶復合體羥腦苷脂 (Cereblon, CRBN) 是一種具有離子蛋白酶活性的大腦相關蛋白，可與 DNA 損傷結合蛋白-1 (DDB1)、滯蛋白 4 (Cullin4, Cul4A 或 Cul4B) 和調(diào)節(jié)因子 Cullins 1 (RoC1) 相互作用形成功能牲 E3 泛素連接酶復合體 (CRBN-CRL4)，結合底物后通過泛素-蛋白酶體途徑進行蛋白水解。Cereblon也是免疫調(diào)節(jié)劑 (IMiD) 抗骨髓瘤作用的必需靶蛋白。Lenalidomide，和 Pomalidomide 等與 CRBN 結合時會招募新的底物，使其結合在 CRBN-CRL4 上，導致其泛素化和蛋白酶體依賴的降解增加。CRBN-CRL4 復合體對四肢的發(fā)育有重要作用。Cullin 蛋白家族的其他成員也可形成不同的 E3 泛素連接酶復合體，如下圖：

PROTAC Linker

PEG類

PROTAC Linker 25 is a polyethylene glycol(PEG)-based PROTAC linker.

Alkyl/ether類

PROTAC Linker 2 is aAlkyl/ether based PROTAClinker.

Alkyl-Chain類PROTAC Linker 31 is a PROTAC linker, which refersto the Alkyl-Chain composition.

SNIPER

SNIPERs (specific and non-geneticinhibitor of apoptosis protein(IAP)-dependentprotein erasers )是一系列凋亡蛋白抑制因子 (IAP) 高效特異性抑制劑，可募集 IAP 泛素連接酶來實現(xiàn)靶向降解。SNIPER - Hijacking IAP 活性以誘導蛋白質(zhì)降解。與招募von Hippel-Lindau 和 cereblon 泛素連接酶的嵌合分子不同，SNIPERs 可以同時降解 IAP (例如 cIAP1 和 XIAP) 以及目標靶蛋白。

Bestatin是一種氨肽酶抑制劑。其甲酯化合物（MeBS）可通過Bestatin結構端與 cIAP1 的 BIR3 結構域結合，激活 cIAP1 的 E3 泛素化連接酶活性，誘導 cIAP1 發(fā)生字泛素化，然后被蛋白酶體降解。所以，在MeBS 通過 linker 連接不同靶蛋白的小分子抑制劑，可以得到多個基于cIAP1 E3 泛素化連接酶的 PTOTAC。但是，由于MeBS可以誘導cIAP1 自身發(fā)生泛素化降解，因此很多基于此技術得到的 PTOTAC 在降解目標靶蛋白的同時會泛素化降低 cIAP1，導致很大程度上限制了其降低靶蛋白的效率。

聰明的科學家們繼續(xù)對Bestatin做進一步的結構改造，發(fā)現(xiàn)Bestatin的酰胺衍生物保留了與 cIAP1 的結合活性，且不會引起 cIAP1 的自身泛素化降解。如SNIPER(ABL)-020，SNIPER(ABL)-044等等。

E3 Ligase Ligand-Linker Conjugate

E3 Ligase Ligand-Linker Conjugate Kit是一個超級豐富的 E3 配體和 Linker 組合試劑盒。里面是一系列合成的化合物，結合了 E3 Ligase 配體和 Linker。另外還提供了不同的類型的 E3 Ligase 配體和多樣化的 Linker 組合任君選擇。

PROTAC 優(yōu)勢

1. 用量小，毒性低

2. 克服靶蛋白突變3. 避免過表達引起的耐藥4. 選擇性高5. 清除蛋白堆積

小 M 的小思考

鑒于大多數(shù)小分子抑制劑的可逆結合，通常需要較大的全身給藥濃度和持續(xù)暴露以確保足夠的抑制。在許多情況下，維持體內(nèi)足夠高的藥物濃度具有挑戰(zhàn)性的。所以，通過小分子誘導的蛋白降解來消除引起疾病的異常蛋白質(zhì)正在發(fā)展為研究的新策略。PROTAC 技術可能令現(xiàn)在還無法成藥的 80% 蛋白組被小分子藥物調(diào)控。PROTAC 小分子研究進展目前主要集中在可靶向的靶點上。未來潛力之一是要靶向傳統(tǒng)意義上不可靶向的靶點，比如轉錄因子、蛋白的骨架功能等。

*聲明：本文由入駐新浪醫(yī)藥新聞作者撰寫，觀點僅代表作者本人，不代表新浪醫(yī)藥新聞立場。

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PROTAC蛋白降解