miRNA研究搭上m6A的熱點，申請基金不用愁。

星星的我bkdrc2 2020-03-30

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我感覺講miRNA有一定意義，因為過去10年很多小伙伴的課題組都研究過miRNA，為了保持課題的延續(xù)性，從RNA甲基化角度繼續(xù)研究過去的miRNA指標(biāo)可能是一個不錯的思路。

接下來正式講解我們的文獻(xiàn)，作者團(tuán)隊來自班主任所在的南京醫(yī)科大學(xué)，這篇文章的題目是：METTL14 Suppresses CRC Progression via Regulating N6-Methyladenosine -Dependent Primary miR-375 Processing。這篇文章發(fā)表在《Molecular Therapy》上，目前影響因子是：8.402。

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先來看研究背景：

這篇文章主要介紹了METTL14通過m⁶A依賴途徑影響miR-375前體成熟進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）發(fā)展的作用機(jī)制。研究背景是分了3個部分：1. CRC的危害等背景；2. m⁶A相關(guān)基因和蛋白的介紹；3. 本研究擬開展的工作：METTL14在CRC組織和細(xì)胞中表達(dá)；METTL14在體內(nèi)外對CRC表型的影響；METTL14影響表型的具體作用機(jī)制。

作者的初心我猜是想靠上研究熱點m⁶A，他們是怎么靠上這個熱點的，直接檢測組織中METTL14的表達(dá)，直接硬靠，厲害了。

文章結(jié)果如下：

圖1. METTL14在CRC細(xì)胞和組織中低表達(dá)，METTL14高表達(dá)的患者預(yù)后良好。

圖1 A：qPCR結(jié)果提示METTL14在CRC細(xì)胞中表達(dá)低于正常結(jié)直腸細(xì)胞。

圖1 B：qPCR結(jié)果提示METTL14在CRC患者組織中表達(dá)低于正常組織。

圖1 C：IHC結(jié)果提示METTL14在CRC患者組織中表達(dá)低于正常組織。

圖1 D：生存分析提示METTL14高表達(dá)的CRC患者預(yù)后良好。

總結(jié)： 基本上就是硬靠上的研究熱點m⁶A。小伙伴自己研究時最好分析下公開數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)如TCGA、GEO等。不足：圖1沒有WB水平檢測METTL14表達(dá)的結(jié)果。此外，IHC的圖染的不太好。

PS：建議大家做表達(dá)檢測的時候 qPCR、WB和IHC的檢測結(jié)果最好都有，這樣數(shù)據(jù)完整度才高。

圖2. 敲低MELLT14促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖。

圖2 A：檢測兩種不同細(xì)胞系中MELLT14的敲低效率。

圖2 B：敲低MELLT14后m⁶A的水平明顯降低。

圖2 C-E：敲低MELLT14后促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展。

總結(jié)：無。

圖3. 上調(diào)MELLT14抑制CRC細(xì)胞增殖。

與圖2類似，圖2是抑制MELLT14表達(dá)，圖3就是說明過表達(dá)MELLT14抑制CRC進(jìn)展。

總結(jié)：無。

圖4. MELLT14抑制CRC細(xì)胞遷移和侵襲。

圖4 就是將前面的增殖表型換成了Migration和Invasion這兩個實驗。

總結(jié)：無。

圖5. MELLT14在裸鼠中發(fā)揮抑癌作用。

圖5 結(jié)果和前面一致。

總結(jié)：無。

中期總結(jié)：全文共8個圖，前5個圖主要講了兩件事：

1. MELLT14在CRC組織和細(xì)胞中低表達(dá)且與患者預(yù)后良好有關(guān)。

2. MELLT14在體內(nèi)外發(fā)揮抑癌作用。

接下來終于到了m⁶A如何和miRNA結(jié)合起來的，也是本文的重點。作者前期已經(jīng)確定了作為m⁶A writer的MELLT14在CRC中發(fā)揮抑癌作用，接下來要探索METTL14調(diào)節(jié)的潛在下游miRNA。

想了解圖6需要學(xué)習(xí)一下其他的知識，如miRNA 的成熟加工過程：

EGCR8作為Drosha的主要結(jié)合蛋白，可以通過其C末端的兩個雙鏈RNA結(jié)合區(qū)域與pri-miRNA結(jié)合，招募并指導(dǎo)Drosha在pri-miRNA的正確位置剪切，生成pre-miRNA，pre-miRNA進(jìn)一步被Dicer酶加工剪切，形成成熟的miRNA。

我猜這個作者團(tuán)隊是學(xué)的這篇論文的思路PMID ：25799998。這篇文獻(xiàn)報道m(xù)⁶A修飾可加速pri-miRNA 的成熟。

圖6. METTL14通過 m⁶A甲基化通過DGCR8影響miR-375的成熟。

圖6 A：通過LinkedOmics database數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)與METTL14表達(dá)呈正相關(guān)的9個 miRNA。

圖6 B：驗證全部miRNA是否與METTL14表達(dá)呈正相關(guān)，敲低METTL14表達(dá)后只有miRNA-375和miR-200a表達(dá)下調(diào)，其余7個miRNA無差異表達(dá)。

圖6 C：過表達(dá)和敲低METTL14后，miRNA-375和miR-200a表達(dá)分別上調(diào)和下調(diào)。

圖6 D：過表達(dá)和敲低METTL14后，primiRNA-375表達(dá)有改變（總之就是和miRNA-375變化趨勢相反），primiRNA-200a表達(dá)無改變。作者選擇miR-375進(jìn)行后續(xù)深入研究。

圖6 E：之前有文獻(xiàn)報道m(xù)6A修飾可促進(jìn)primiRNA成熟，經(jīng)生信預(yù)測primiRNA-375存在一個潛在可發(fā)生m⁶A修飾的A，將此位點突變?yōu)門后，成熟的miRNA-375表達(dá)降低。這些數(shù)據(jù)說明primiRNA-375的位點A可能存在m⁶A修飾，且此修飾促進(jìn)primiRNA-375成熟，增加了miR-375表達(dá)。

圖6 F：做RIP實驗（IP抗體為DGCR8）。與對照組相比，轉(zhuǎn)染METTL14組后。DGCR8蛋白富集到的primiRNA-375顯著提高。意味著有更多的primiRNA-375被DGCR8加工成miR-375。和圖6 C和圖6 D的結(jié)果一致拉。

圖6 G：做MeRIP實驗（IP抗體為m⁶A）。與對照組相比，轉(zhuǎn)染METTL14組的primiRNA-375的m⁶A修飾水平顯著提高。

總結(jié)：這塊是文章的重點，這塊的理解需要學(xué)一下miRNA從primiRNA到成熟miRNA 的加工過程。我之前也不是很熟悉這塊，也是現(xiàn)學(xué)現(xiàn)賣，如果哪里講的不對請指正。我的經(jīng)歷告訴小伙伴們我們學(xué)習(xí)文獻(xiàn)不可能啥都會，很多時候需要自己先查一些知識來理解文獻(xiàn)的思路。基本上這個文章把這個圖學(xué)會了就是成功，其他圖都是傳統(tǒng)的套路。

圖7 . METTL14通過影響miR-375發(fā)揮抑癌作用。

圖7 A-C：miR-375在患者組織較正常組織低表達(dá)；高表達(dá)miR-375的患者預(yù)后良好；METTL14和miR-375呈正相關(guān)。

圖7 D-M：METTL14通過影響miR-375發(fā)揮抑癌作用。

總結(jié)：無。

很多其他文獻(xiàn)報道了miR-375的靶基因包括YAP1，SP1，AEG1， PDK1， IGF1R和JAK2等基因。作者想探索METTL14是否影響miR-375下游靶基因的表達(dá)。

圖8. METTL14通過miR-375/YAP1 and miR-375/SP1 通路在CRC中發(fā)揮抑癌作用。

圖8 A：qPCR檢測結(jié)果提示METTL14過表達(dá)后促進(jìn)miR-375表達(dá)。

圖8 B：WB檢測結(jié)果提示METTL14抑制miR-375下游靶基因YAP1和SP1的表達(dá)。

圖8 C：將之前裸鼠成瘤實驗中的組織包成蠟塊，shMETTL14組較shNC組中的YAP1和SP1表達(dá)高，過表達(dá)組反之亦然。

圖8 D：驗證了其他文獻(xiàn)中報道的miR-375可抑制YAP1和SP1的表達(dá)。

圖8 E：對圖8 A的回復(fù)實驗。

圖8 F-I：METTL14通過miR-375/YAP1 and miR-375/SP1 通路在CRC中發(fā)揮抑癌作用。

總結(jié)：無。

不足：這個圖的給我的感覺就是湊數(shù)，做的不認(rèn)真哈。應(yīng)該單獨(dú)做一做過表達(dá)和敲低后YAP1和SP1對CRC表型的影響。miR-375通過YAP1和SP1影響CRC表型。最后再做METTL14通過YAP1和SP1影響CRC表型是不是更好。

全文總結(jié)：

選擇此論文原因：

我認(rèn)識的很多人在過去10年都研究過miRNA。這些人大部分都轉(zhuǎn)向了LncRNA和circRNA的研究。2015-2018年期間有些小伙伴及時轉(zhuǎn)向了LncRNA和circRNA的ceRNA機(jī)制，大多數(shù)人都中了有關(guān)ceRNA機(jī)制的國自然。但是2020年再做ceRNA機(jī)制就不太合適拉，可以將過去的miRNA和外泌體、可變剪接等方向結(jié)合，當(dāng)然m⁶A也是一個不錯的思路。我講此文僅希望給大家提供一個潛在思路。

我學(xué)到的知識：

1. 整體來說，文章的配色不錯，值得學(xué)習(xí)。

2. 這篇文章嚴(yán)格意義上講是一篇涉及兩個主變量的文章，兩個主變量分別為METTL14和miR-375。第一個主角METTL14就是硬靠。我不建議這樣做，這樣的做法現(xiàn)在能發(fā)8分，以后5分都夠嗆。第二個主角miR-375是公開數(shù)據(jù)庫的生信分析+低通量驗證，這個思路值得學(xué)習(xí)。

3. 表型檢測最好是過表達(dá)和敲低都做，這篇文章做的很好。

4. 檢測上游基因是否影響下游基因（如YAP1，E-cad等）的表達(dá)很有必要，畢竟很多下游基因編碼的蛋白是真正發(fā)揮作用影響疾病表型的。

其他感受：

1. 這篇文章看起來不太難，但是人家就在2020年2月發(fā)表在了8分多的雜志上。為什么思路不難的文章也能發(fā)高分？

我的理解：本文之所以能發(fā)8分多，就是因為作者研究的是熱點m⁶A，我兩三個月前真看過一篇工作量相當(dāng)?shù)年P(guān)于細(xì)胞周期研究的文章，也是8個圖只發(fā)了3.8分，這就是蹭熱點的重要性。這提示我們今后做研究盡量早點結(jié)合熱點，行動晚了就不好說了，而且后做的門檻會越來越高。我們寫基金也不能盲目追熱點，沒有前期基礎(chǔ)也很難中標(biāo)的。

2. 我們不應(yīng)該盲目追求一個文章涉及多個指標(biāo)的間接作用，例如A-B-C-D-E信號通路影響某疾病的某表型，然后每個環(huán)節(jié)都做的不細(xì)致。我們應(yīng)該立足兩三個指標(biāo)，把每個指標(biāo)的具體功能和兩兩之間的關(guān)系作完整做細(xì)致。這篇8分文章在這方面做的很好，值得我們學(xué)習(xí)。

3. 截止目前，miRNA和m⁶A結(jié)合起來研究的文章不太多，我目前沒查到5篇，南京醫(yī)大很多團(tuán)隊偏愛這個方向哈，我本來打算講另一篇同樣來自南京醫(yī)科大學(xué)的論文（PMID：31228940），有感興趣的小伙伴可以自己讀一讀。

部分miRNA和m⁶A結(jié)合相關(guān)的國自然基金名稱：

1. ALKBH5調(diào)控Pri-miR-21的m⁶A甲基化促進(jìn)胰腺癌化療敏感性的機(jī)制研究（上海交通大學(xué)，2018年）

2. METTL3通過介導(dǎo)pri-miR-145的m⁶A甲基化抑制腎癌惡性進(jìn)展的機(jī)制研究（南京醫(yī)科大學(xué)，2017年）

3. METTL14通過介導(dǎo)pri-miR-17的m⁶A修飾促進(jìn)心肌梗死后心肌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究（南京醫(yī)科大學(xué)，2018年）

以上就是關(guān)于miRNA與m⁶A研究結(jié)合的文獻(xiàn)分享，希望對大家有所幫助。

本文作者

土豆：暫時不想拋頭露面，希望做一個具有分享精神的人。

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