microRNA是來源于前體轉(zhuǎn)錄本的約22核苷酸的非編碼RNA調(diào)控序列【1】。每個(gè)miRNA都與一個(gè)Argonaute（AGO）蛋白形成一個(gè)沉默復(fù)合體，miRNA與靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本配對(duì)隨后AGO蛋白促進(jìn)靶標(biāo)變得不穩(wěn)定或者是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制【2】。哺乳動(dòng)物中最保守的90個(gè)miRNA家族有平均超過400個(gè)保守的靶標(biāo)。這保守的90個(gè)miRNA家族通過小鼠中的敲除實(shí)驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)于動(dòng)物的正常生長(zhǎng)發(fā)育和生理過程有著非常重要的作用【1】。miRNA結(jié)合靶點(diǎn)的效率對(duì)于理解miRNA的作用過程和作用機(jī)制大有裨益，但是對(duì)于miRNA-AGO復(fù)合物與靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間結(jié)合親和力的檢測(cè)一直沒有很好的方法。

近日，Whitehead研究所David P. Bartel研究組在Science發(fā)表文章The biochemical basis of microRNA targeting efficacy，對(duì)RNA bind-n-seq（RBNS）測(cè)序進(jìn)行優(yōu)化，用于測(cè)量miRNA-AGO復(fù)合體與所有小于12nt靶標(biāo)結(jié)合的相對(duì)親和力的大小，為定量測(cè)量miRNA對(duì)于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的結(jié)合效率提供了重要的生物化學(xué)基礎(chǔ)。

靶標(biāo)結(jié)合的效率是miRNA-AGO復(fù)合體與靶標(biāo)序列之間的親和力的大小，在這種情況下，與目標(biāo)位點(diǎn)的更大親和力將導(dǎo)致該位點(diǎn)的占用率增加，從而增加對(duì)目標(biāo)mRNA的抑制。直到最近，僅有三個(gè)miRNA對(duì)于極少數(shù)的靶標(biāo)mRNA的結(jié)合親和力是被深入研究過的【3-5】。高通量的成像和切割分析提供了眾多miRNA中僅let-7a和miR-21兩個(gè)的大量結(jié)合和切割方面的數(shù)據(jù)【6】。但是這其中給出的數(shù)據(jù)仍然不足以對(duì)不同miRNA之間的靶向性不同機(jī)理更加深入的了解，也無法建立miRNA介導(dǎo)的抑制作用相關(guān)的、更為普遍的非切割模式的靶向效能信息生化模型【6】。

為了能夠擴(kuò)展目前對(duì)于miRNA結(jié)合靶標(biāo)親和力的認(rèn)識(shí)，作者們對(duì)RBNS技術(shù)進(jìn)行了升級(jí)改造【7】，RBNS技術(shù)可以提供對(duì)RNA結(jié)合蛋白與結(jié)合位點(diǎn)的相對(duì)結(jié)合的定性測(cè)量。在該方法中，純化后的RNA結(jié)合蛋白與一個(gè)大的RNA分子庫進(jìn)行孵育，所有的RNA分子都具有一個(gè)相同的引物結(jié)合序列。在達(dá)到結(jié)合平衡后，該蛋白被pull-down下來，任何被共同純化下來的RNA分子被反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增然后進(jìn)行測(cè)序（圖1）。為了將該技術(shù)擴(kuò)展到對(duì)于AGO-miRNA復(fù)合體中進(jìn)行使用，作者們純化了AGO2-miR-1【8】，并且設(shè)置了五個(gè)不同濃度的結(jié)合反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，以及具有37nt隨機(jī)結(jié)合序列的RNA庫。進(jìn)一步地，作者們?cè)趐ull-down蛋白時(shí)改用了硝化纖維素膜，可以增加低親和力蛋白的滯留。優(yōu)化后的方法提供了AGO2對(duì)于其結(jié)合位點(diǎn)的相對(duì)強(qiáng)度的量化，而且沒有差異交聯(lián)效率的混淆效應(yīng)，使得該方法能夠用于miRNA靶向的定量測(cè)量。

隨后作者使用優(yōu)化后的RBNS對(duì)另外的哺乳動(dòng)物中l(wèi)et-7、miR-7、miR-124、miR-155以及線蟲中l(wèi)sy-6的這五個(gè)miRNA的結(jié)合親和力進(jìn)行了測(cè)量。選擇let-7、miR-7、miR-124、miR-155是因?yàn)檫@些miRNA序列保守而且已經(jīng)對(duì)于其調(diào)控活性、體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)以及體外的結(jié)合親和力數(shù)據(jù)有一定的了解。而選擇lsy-6是因?yàn)樵搈iRNA已知對(duì)于其靶點(diǎn)的結(jié)合能力非常微弱。作者們通過RBNS后的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)這些miRNA對(duì)于經(jīng)典靶點(diǎn)具有很好的結(jié)合，說明該高通量技術(shù)具有很好的適應(yīng)性。而對(duì)于一些非經(jīng)典的結(jié)合，部分在之前的文章中有零星報(bào)道，而另外一些非經(jīng)典的結(jié)合可能是對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有著廣泛的抑制，數(shù)據(jù)結(jié)果與背景無太大差異。

為了進(jìn)一步確認(rèn)該技術(shù)的作用，作者們?cè)诩?xì)胞中對(duì)miRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)于靶點(diǎn)抑制效率與其測(cè)量得到的相對(duì)平衡解離常數(shù)之間的對(duì)應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。作者們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中的結(jié)果與相對(duì)KD常數(shù)之間有著很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。有了這樣在細(xì)胞內(nèi)相對(duì)一致的抑制關(guān)系，作者們通過測(cè)量一個(gè)miRNA與任何12nt序列的相對(duì)結(jié)合親和力，來模擬6個(gè)miRNA對(duì)每個(gè)細(xì)胞mRNA的定量影響，建立了一個(gè)生物化學(xué)框架用以預(yù)測(cè)一個(gè)miRNA對(duì)于每個(gè)mRNA的抑制程度。

總的來說，作者們通過將RBNS技術(shù)進(jìn)行改造，建立了一種對(duì)miRNA-AGO復(fù)合體與靶點(diǎn)高通量相對(duì)結(jié)合親和力檢測(cè)的方式，建立了對(duì)于miRNA-靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于未來更好地了解和預(yù)測(cè)miRNA靶向功能提供了重要的生物化學(xué)基礎(chǔ)。

1. Bartel, D. P. Metazoan MicroRNAs. Cell 173, 20-51, doi:10.1016/j.cell.2018.03.006 (2018).

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4. Schirle, N. T., Sheu-Gruttadauria, J. & MacRae, I. J. Structural basis for microRNA targeting. Science 346, 608-613, doi:10.1126/science.1258040 (2014).

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