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https:///10.1038/s41467-019-10669-0

本研究分析了黑色素瘤中m⁶A去甲基化酶FTO調(diào)控腫瘤進(jìn)展、以及影響PD-1抗體治療效果。黑色素瘤患者以及小鼠模型中，F(xiàn)TO的水平明顯上升；饑餓處理促進(jìn)FTO的表達(dá)水平。FTO敲除后m⁶A甲基化增加，包括原癌基因PD-1、CXCR4、SOX10等，通過YTHDF2催化RNA降解。因此在黑色素瘤細(xì)胞系中敲低FTO能夠增強(qiáng)其對(duì)于IFNg的敏感型，及其PD-1抗體治療作用；并借此提出FTO抑制劑聯(lián)合PD-1用藥在黑色素瘤免疫治療中的作用。

首先研究者發(fā)現(xiàn)FTO在黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)遠(yuǎn)高于正常皮膚黑色素細(xì)胞（Fig 1a-b）；黑色素瘤細(xì)胞系中同樣發(fā)現(xiàn)FTO水平升高（Fig 1c）。

在FTO高表達(dá)的黑色素瘤細(xì)胞系Mel624等敲低FTO（Fig 2a），能夠抑制細(xì)胞增殖、生長、遷移和侵襲（Fig 2b-e）；同時(shí)FTO敲低的細(xì)胞在體內(nèi)同樣抑制腫瘤生長（Fig 2f-g）。

Figure 1

Figure 2

FTO敲低后，細(xì)胞中mRNA的總體m⁶A水平上升（Fig 3a-d）。過表達(dá)m⁶A的催化酶METTL3/14同樣能夠提高m⁶A的水平（Fig 3e），也能抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖（Fig 3g），轉(zhuǎn)移和侵襲（Fig 3h-i）。此外，F(xiàn)TO敲低對(duì)細(xì)胞的影響能夠被METTL3/14敲低遏制

（Fig 3j-m），進(jìn)一步說明FTO的生物學(xué)功能依賴于m⁶A。

Figure 3

通過轉(zhuǎn)錄組、m⁶A測(cè)序、芯片等綜合分析（Fig 4a），F(xiàn)TO敲低影響PD-1的RNA水平，對(duì)PD-L1/CD47沒有影響（Fig 4b）。此外分析發(fā)現(xiàn)FTO敲低后5‘和3’ UTR上m⁶A的水平提高（Fig 4c），并且改變m⁶A的定位（Fig 4d）；含有m⁶A修飾的基因數(shù)目有所增加（Fig 4e），但結(jié)合位點(diǎn)一致（Fig 4f）。并且FTO敲低抑制表達(dá)的基因，多表現(xiàn)為m⁶A水平上升（Fig 4g-h）。

Figure 4

以上的下游基因中，PD-1已知是重要的致癌基因；PD-1下游影響mTOR；此外CXCR4、SOX10等也都是黑色素瘤關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，都受到FTO的調(diào)節(jié)（Fig 5a-b）。在FTO敲低細(xì)胞中過表達(dá)PD-1，能夠激活mTOR下游S6K的磷酸化水平（Fig 5c），并進(jìn)一步影響細(xì)胞增殖（Fig 5d）和遷移（Fig 5e）。CXCR4和SOX10也具有同樣的作用（Fig 5f-i）。此外，F(xiàn)TO敲低的同時(shí)繼續(xù)敲低METTL3/14，則能夠提高PD-1、CXCR4和SOX10的水平（Fig 5j-o），說明FTO對(duì)下游基因的控制依賴于m⁶A。

Figure 5

已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，RNA的m⁶A修飾調(diào)節(jié)其表達(dá)依賴于m⁶A的reader，即YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白。FTO敲低不會(huì)影響m⁶A催化酶（MELL）和reader（YTHDF1-3）的水平（Fig 6a）。YTHDF1/3敲低都不會(huì)影響下游基因的mRNA水平，只有YTHDF2敲除后下游RNA增多（Fig 6b-d）。此外，F(xiàn)TO敲低導(dǎo)致下游mRNA的穩(wěn)定性降低（Fig 6e-g），而YTHDF2敲低則增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性（Fig 6h-j），且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)和體外的生長和遷移（Fig 6k-l）。

Figure 6

研究者進(jìn)一步分析了黑色素瘤中FTO水平提高的原因，發(fā)現(xiàn)血清饑餓（FBS 0.2%）、和常規(guī)饑餓都能夠促進(jìn)其表達(dá)（Fig 7a-b），并伴隨m⁶A水平下降（Fig 7c）。由于饑餓與自噬緊密相連，研究者分析了自噬關(guān)鍵性蛋白ATG5/7，發(fā)現(xiàn)其敲除會(huì)減少FTO對(duì)于饑餓的正響應(yīng)（Fig 7d），以及其下游基因PD-1和NFkB通路（Fig 7e）。此外NFkB-p65敲低也能夠抑制FTO和PD-1水平（Fig 7f-g），證明FTO和PD-1受到自噬和NFkB通路的影響。

Figure 7

FTO促進(jìn)黑色素瘤進(jìn)展，在FTO高表達(dá)的B16F10細(xì)胞引起的腫瘤中，PD-1抗體不起作用（Fig 8a），而敲除FTO后則起到抗腫瘤作用（Fig 8a-b）。分析發(fā)現(xiàn)FTO敲低的腫瘤中PD-1抗體處理使得CD4+ T細(xì)胞浸潤增加（Fig 8c），而CD8+ T細(xì)胞無差別；此外產(chǎn)生IFNg的CD4+和CD8+ T細(xì)胞浸潤都沒有變化（Fig 8d）。分析原因發(fā)現(xiàn)，IFNg刺激下FTO水平降低（Fig 8e），m⁶A水平升高（Fig 8f）；此外FTO水平降低促進(jìn)IFNg刺激下的細(xì)胞死亡和生長受阻/升高則相反（Fig 8g-h）；同時(shí)FTO下游CXCR4、PD-1、SOX10等的過表達(dá)同樣能夠抑制IFNg導(dǎo)致的細(xì)胞死亡（Fig 8i-k）。IFNg抗體處理同樣能促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長（Fig 8l）。

Figure 8

本研究立足FTO，分析了分子功能，即去除mRNA的m⁶A修飾；生物學(xué)功能，即在黑色素瘤中的促癌作用。并且通過分子機(jī)理分析，發(fā)現(xiàn)抑制FTO導(dǎo)致全mRNA的m⁶A水平升高、以及關(guān)鍵性促癌基因PD-1、CXCR4、SOX10的m⁶A升高；高水平的m⁶A被reader-YTHDF2識(shí)別、并導(dǎo)致穩(wěn)定性降低，從而降低下游基因的mRNA水平。通過調(diào)節(jié)這些下游基因水平，F(xiàn)TO調(diào)節(jié)黑色素瘤腫瘤進(jìn)程。此外FTO水平的降低能夠促進(jìn)腫瘤對(duì)于PD-1抗體的敏感性，故聯(lián)用有望達(dá)到更佳的治療效果。在這個(gè)過程中INFg同樣起到調(diào)節(jié)作用。

Seungwon Yang. et al. m⁶A mRNA demethylase FTO regulates melanoma tumorigenicity and response to anti-PD-1 blockade. Nature Communications. (2019) 10:2782.

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