一天tRNA急急忙忙找到mRNA告訴他：聽朋友圈里說課題組核酸界里多了一個(gè)環(huán)形的胖子RNA，功能齊全更重要的是可以編碼蛋白，mRNA一聽，像熱鍋上的螞蟻火急火燎的來看看到底這個(gè)環(huán)形的胖子如何編碼蛋白的？

那么今天分析的文章題目是《Extensive translation of circular RNAs driven by N 6 -methyladenosine》（回復(fù)170828可下載，一周有效）。circRNA主要通過反式剪切內(nèi)含子而來，與mRNA相比其可是去了頭又掐了尾，一個(gè)非經(jīng)典的剪切過程。

有大量的報(bào)道研究circRNA可以作為miRNA sponges與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mRNA，也被稱為ceRNA，從而調(diào)控mRNA的翻譯和表達(dá)。大部分的環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能還未曾可知。但是一個(gè)有趣的觀點(diǎn)是circRNA可以翻譯成蛋白，編碼蛋白，那么就來看看其是如何編碼的吧！

N6甲基化（m⁶A）的基本介紹：

（1）m⁶A  在真核細(xì)胞中的表達(dá)廣泛。

（2）m⁶A  腺苷的甲基化被甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物（METTL3，METTL14以及Wilms’ tumor 1相關(guān)蛋白）所催化；m⁶A  可以被脂肪、FTO以及AKLBH5去甲基化。

（3）m⁶A  能夠被YTH家族（YTHDF1, YTHDF12 和YTHDF13）結(jié)構(gòu)域所識(shí)別。

（4）含有IRES的環(huán)狀RNA可翻譯蛋白，正如IRES一樣，含有m6A的環(huán)狀RNA中也翻譯蛋白。

以下就是文章的主要內(nèi)容介紹

第一：含有m⁶A 基序的環(huán)狀RNA能夠表達(dá)GFP蛋白。

作者早前的研究工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有IRES元件的反向拼接形成的環(huán)狀RNA可表達(dá)完整的GFP蛋白，課題組進(jìn)一步驗(yàn)證該現(xiàn)象時(shí)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)驚人的結(jié)果：其它三個(gè)陰性對(duì)照組（不含IRES元件）都可以促進(jìn)GFP的翻譯。為什么會(huì)出現(xiàn)這個(gè)奇怪的現(xiàn)象，原因是在起始位點(diǎn)附近都包含了RRACH片段，聚集了m⁶A  序列。

第二：m⁶A  最近被發(fā)現(xiàn)增加信使rna 的翻譯效率。

研究觀察的結(jié)果顯示m⁶A  聚集的RRACH的序列，可能卷入到了環(huán)狀RNA的起始翻譯過程中。

為了驗(yàn)證這個(gè)假說，課題組在circRNA報(bào)告基因起始密碼子之前插入了含m⁶A  保守基序不同拷貝數(shù)的短片段，并檢測(cè)在293細(xì)胞中GFP蛋白的表達(dá)量。

如課題組預(yù)想的一樣，包含一個(gè)或者兩個(gè)基序的circRNA都翻譯了蛋白，而且突變的兩個(gè)基序明顯減少了GFP的表達(dá)量。另外有一個(gè)基序位點(diǎn)的環(huán)狀RNA與擁有兩個(gè)的基序位點(diǎn)相比有著同樣的翻譯效率，表明一個(gè)基序位點(diǎn)足夠引起翻譯，而當(dāng)circRNA插入空白腺苷酸序列的時(shí)候，GFP就不表達(dá)了。

另外，課題組也檢測(cè)了其它兩種序列RSV 和RSVns，這兩個(gè)序列已經(jīng)被報(bào)道可以被m⁶A  修飾，而且這兩種序列可以明顯的增加蛋白翻譯。更重要的是突變?cè)撔蛄性跍p少了m⁶A  的甲基化水平的同時(shí)，也同樣削減了翻譯效率，進(jìn)一步證明了m⁶A  能夠促使環(huán)狀RNA翻譯蛋白。

第一：驗(yàn)證m⁶A  序列是否一定要被甲基化才能促使環(huán)狀RNA翻譯。

課題組通過m⁶A  的抗體沉淀了中包含RSV m⁶A  位點(diǎn)的環(huán)狀RNA以及SON mRNA的蛋白，但是對(duì)照組卻不能沉淀下來。包含m⁶A  序列突變的環(huán)狀RNA也能被m⁶A  的抗體沉淀下來，但是翻譯效率急劇下降。

這些結(jié)果顯示，突變能夠減少部分但不能完全消減在RSV 位點(diǎn)上的m⁶A  的甲基化。

第二：共轉(zhuǎn)m⁶A  的去甲基化酶 FTO顯著減少了SON mRNA和circRNA 中GFP的蛋白表達(dá)量。

這些都表明具有m⁶A  位點(diǎn)的circRNA/mRNA是甲基化的，而且環(huán)狀RNA的翻譯需要m⁶A  的甲基化。

第三：共轉(zhuǎn)m⁶A   的甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14可以顯著增加 RNA-IP的信號(hào)。

在具有m⁶A基序的環(huán)狀RNA組和mRNA組中，而在對(duì)照組中是沒有增加的。同時(shí)，環(huán)狀RNA組中，也顯示增加了蛋白的翻譯水平。

有趣的是，當(dāng)單獨(dú)轉(zhuǎn)染METTL14 時(shí)效果是不穩(wěn)定的，但是當(dāng)共轉(zhuǎn)METTL3/14時(shí)不僅穩(wěn)定了METTL14而且也誘導(dǎo)了GFP蛋白的翻譯，這也可能提供了一個(gè)信息：METTL3/14很可能形成了一個(gè)復(fù)合物。

課題組還發(fā)現(xiàn) FTO 或者 METTL3/14的表達(dá)不能夠改變環(huán)狀RNA的水平，表明m⁶A  的修飾對(duì)環(huán)狀RNA的穩(wěn)定性不影響。這個(gè)觀察結(jié)果與之前報(bào)道的m⁶A  的修飾促進(jìn)線性RNA的降解不同，這也從側(cè)面反映了環(huán)狀RNA有很好地穩(wěn)固性，m⁶A  的修飾帶來的小的不穩(wěn)定不明顯或者環(huán)狀RNA的降解與線性RNA的機(jī)制不同。

第一：m⁶A  能夠促進(jìn)環(huán)狀RNA的翻譯需要蛋白因子eIF4G2的參與。

課題組使用穩(wěn)定的細(xì)胞系表達(dá)兩種eIF4G2的干擾RNA，而后在環(huán)狀RNA和線性RNA中分別檢測(cè)編碼蛋白GFP的情況。

如所想的一樣，eIF4G2敲除的顯著減少了環(huán)狀RNA翻譯成蛋白，但是對(duì)線性RNA生成蛋白不影響。同樣的，去除eIF3A時(shí)，eIF3A是eIF3的一個(gè)亞基，可與病毒IRES相結(jié)合，能夠顯著減少環(huán)狀RNA對(duì)蛋白的翻譯但是對(duì)線性RNA沒有影響。

第二：課題組探索識(shí)別m⁶A  的蛋白是否是環(huán)狀RNA翻譯蛋白的必須蛋白。

課題組發(fā)現(xiàn)通過RNAi技術(shù)在環(huán)狀RNA和線性RNA中都敲除YTHDF1后不能夠影響翻譯成蛋白，而且YTHDF2敲除后輕度的抑制了GFP蛋白的生成，然而敲除YTHDF3后顯著的抑制了環(huán)狀RNA中GFP蛋白的生成而對(duì)線性RNA沒有影響，表明YTHDF3是m⁶A促使環(huán)狀RNA起始翻譯的識(shí)別蛋白。

而且通過CO-IP分析YTHDF3可以與eIF4G2相互結(jié)合，YTHDF3招募eIF4G2促使m⁶A翻譯蛋白。

以上實(shí)驗(yàn)部分已經(jīng)做了豐富的驗(yàn)證，那么接下來就是計(jì)算機(jī)的事了

為了評(píng)估細(xì)胞中的環(huán)狀RNA m⁶A 修飾調(diào)節(jié)的重要性，課題組進(jìn)行了測(cè)序，并且通過m⁶A  -IP鑒定出13%總環(huán)狀RNA具有m⁶A修飾特性。

第一：根據(jù)以上的觀察，課題組開發(fā)了一個(gè)計(jì)算機(jī)通道去預(yù)測(cè)內(nèi)源性可翻譯的環(huán)狀RNA。

首先在Hs68細(xì)胞系中通過耐RNase R性質(zhì)篩選7771個(gè)環(huán)狀RNA，第一次課題組就篩選出了623個(gè)環(huán)狀RNA 包含m⁶A 峰值。再用pre-mapped TIS技術(shù)又一次篩選出124個(gè)環(huán)狀RNA。最后課題組應(yīng)用了一個(gè)任意長(zhǎng)度的開放閱讀框進(jìn)行篩選，篩選出25個(gè)環(huán)狀RNA。在25個(gè)環(huán)狀RNA中與核糖體有關(guān)系的。

第二：以上的這些結(jié)果促使課題組驗(yàn)證這些具有翻譯性質(zhì)的環(huán)狀RNA在人基因組信息中的匹配信息。

首先用梯度離心純化出多蛋白體相關(guān)的RNAs，然后將樣本用RNaseR消化處理后進(jìn)行高通量測(cè)序。篩選出了250個(gè)與多蛋白體相關(guān)的環(huán)狀RNA，只有二十五分之一可翻譯的環(huán)狀RNA被預(yù)測(cè)到，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)方法尚有不足。

當(dāng)與所有的環(huán)狀RNA做比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)多蛋白體相關(guān)的環(huán)狀RNA有很少的外顯子組成而且基本上都很短；但是具有較長(zhǎng)的開放閱讀框，這一點(diǎn)與預(yù)想的編碼蛋白一致。

第三：課題組將單體和多蛋白體相關(guān)的環(huán)狀RNA用熒光定量PCR技術(shù)去驗(yàn)證，所選的7個(gè)環(huán)狀RNA是已經(jīng)確認(rèn)與核糖體相關(guān)。

以上這些結(jié)果表明，包含m⁶A  并具有編碼蛋白功能的環(huán)狀RNA在人類基因組中是廣泛分布。

為了直接驗(yàn)證環(huán)狀RNA編碼的內(nèi)源性蛋白，課題組設(shè)計(jì)了一個(gè)數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包含測(cè)序分析出的反式剪切的環(huán)狀RNA的肽段，而且將這些肽段與蛋白數(shù)據(jù)庫聯(lián)系起來。結(jié)果課題組篩選出33個(gè)肽段，但是與蛋白數(shù)據(jù)庫匹配的不是很多。

為了更深一步探索候選的環(huán)狀RNA編碼的肽段，課題組使用化學(xué)方法人工合成候選環(huán)狀RNA編碼的肽段然后去進(jìn)行質(zhì)譜分析。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)合成的環(huán)狀RNA的肽段與原始的肽段相匹配，表明經(jīng)過蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的肽段可能是產(chǎn)生于環(huán)狀RNA的翻譯。這些肽段僅僅是環(huán)狀RNA編碼蛋白質(zhì)組的一小撮，因?yàn)橹挥须亩螠y(cè)序到反式剪接相連才是環(huán)狀RNA編碼的產(chǎn)物。

如果你覺得文中內(nèi)容太多，那看看作者嘔心瀝血作的m⁶A 促使環(huán)狀RNA翻譯的模式圖吧！如下：

m⁶A 促使的起始翻譯需要起始轉(zhuǎn)錄因子eIF4G2和m⁶A 閱讀器YTHDF3的參與，增強(qiáng)翻譯的是甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14，抑制翻譯的是去甲基化酶 FTO。