1、高效、可控、靈活!上海生科院趙國(guó)屏/王金改造新型CRISPRi系統(tǒng)

該研究通過(guò)突變天然crRNA的DR 基序來(lái)影響其介導(dǎo)的CRISPRi系統(tǒng)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄抑制效率，通過(guò)選擇不同DR基序，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因進(jìn)行不同效率的轉(zhuǎn)錄抑制，建立對(duì)靶基因精準(zhǔn)調(diào)控的CRISPRi方法。文章利用gfp熒光報(bào)告系統(tǒng)和流式分選技術(shù)，建立不同DR基序的crRNA與其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄抑制強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

文章還將篩選的介導(dǎo)不同轉(zhuǎn)錄抑制效率的crRNA DR數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用于DsRed基因和內(nèi)源性基因，論證了精準(zhǔn)調(diào)控CRISPRi方法同樣適應(yīng)于其他的基因。此外，文章還利用RNA凝膠遷移實(shí)驗(yàn)明確不同DR基序的crRNA與ddAsCas12a、靶DNA的親和力關(guān)系，闡明不同DR基序影響CRISPRi轉(zhuǎn)錄抑制效率的分子基礎(chǔ)。

CRISPR/ddCas12a系統(tǒng)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的精確調(diào)控

本文所建立的精準(zhǔn)的CRISPRi方法有望應(yīng)用于工業(yè)微生物的工程改造中，通過(guò)精準(zhǔn)調(diào)控生物合成通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)豐度，以減少宿主菌的代謝負(fù)荷，探索增加目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的潛在方案。此外，將大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用到人源細(xì)胞中，擬在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)建立精確的CRISPRi方法，可以進(jìn)一步的促進(jìn)我們對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的研究。

2、上海生科院發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas12新活性，基因編輯又上升一個(gè)新高度

CRISPR相關(guān)蛋白Cas12a（以前稱為Cpf1）是VA CRISPR系統(tǒng)的核酸內(nèi)切酶，已應(yīng)用于體內(nèi)基因組編輯和體外DNA裝配。Cas12a由單個(gè)CRISPR RNA（crRNA）具有豐富的T-protospacer相鄰基序（PAM）序列切割雙鏈DNA（dsDNA）的目標(biāo)的指導(dǎo)下，產(chǎn)生粘性末端。從Cas9，Cas12a切割不同無(wú)論在RuvC催化口袋靶向dsDNA的靶和非靶鏈通過(guò)單活性位點(diǎn)。此外，Cas12a也處理前體crRNAs以產(chǎn)生成熟的crRNA。然而，Cas12a對(duì)單鏈DNA（ssDNA）靶標(biāo)的切割活性不太清楚。

測(cè)定Cas12a / crRNA /靶DNA復(fù)合物的ssDNA切割活性

文章研究表明ssDNA的切割活性，包括順式和反式切割，在Cas12a蛋白中都是普遍存在的。值得注意的是，Cas12a是迄今為止第一個(gè)特征性Cas蛋白，其三元復(fù)合物具有反式-ssDNA切割活性。考慮到環(huán)境中存在大量單鏈病毒，Cas12a可能在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮ssDNA切割活性，可能成為防止外源ssDNAs入侵的有力工具。

除了Cas12a之外，還發(fā)現(xiàn)了來(lái)自2型VI型CRISPR系統(tǒng)的RNA引導(dǎo)的和RNA靶向的CRISPR效應(yīng)子Cas13a（以前稱為C2c2），其具有對(duì)RNA 的反式切割活性。最近，Cas13a的這一特性已成功用于快速且靈敏的核酸檢測(cè)。因此，研究中表征的Cas12a的切割活性也可以以類似的方式用于潛在的生物技術(shù)應(yīng)用中。由于不同的Cas12a復(fù)合物在dsDNA上顯示出不同的反式切割活性，因此深入的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

3、深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院王金/中科院植物生理生態(tài)所趙國(guó)屏團(tuán)隊(duì)等開(kāi)發(fā)新CRISPR / dCas9的系統(tǒng)（CRISPR / dCas9-R2）

 隨著CRISPR（聚集的規(guī)則間隔短回文重復(fù)）技術(shù)的改進(jìn)，催化dCas9與TET1（TET1CD）的催化結(jié)構(gòu)域融合以羥基化特定基因座并激活位點(diǎn)特異性去甲基化。雖然這種CRISPR系統(tǒng)帶來(lái)了很多便利，但它需要表達(dá)外源TET1酶，因此可能對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)生意想不到的影響。為了最大限度地減少外來(lái)成分的引入，研究人員開(kāi)發(fā)了一種新的基于CRISPR/ dCas9的系統(tǒng)（CRISPR/ dCas9-R2），通過(guò)阻斷靶基因座中的DNMT1活性來(lái)降低DNA甲基化水平。具體地，將具有莖 - 環(huán)結(jié)構(gòu)的短RNA序列（命名為R2-莖環(huán)）引入單引導(dǎo)RNA（sgRNA）支架的四環(huán)和莖環(huán)2的兩個(gè)位置。然后，DNMT1被R2-莖環(huán)特異性募集，其酶活性在與R2-莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合后被抑制，因此靶DNA基因座的甲基化被阻斷。

基于DNA 甲基化的CRISPR/dCas9-R2系統(tǒng)

在該研究中，研究人員描述了一種可編程方法，用于方便活細(xì)胞中靶DNA序列的去甲基化。考慮到識(shí)別不同PAM位點(diǎn)的多個(gè)Cas9突變體的可用性，使用dCas9或其他dCas9突變體的CRISPR/ dCas9-R2系統(tǒng)可能具有靶向任何DNA序列的潛力。與目前可用于靶向DNA去甲基化的基于CRISPR的方法相比，結(jié)果顯示出與CRISPR/ dCas9-TET1系統(tǒng)類似的編輯效率，但不需要共轉(zhuǎn)染其他表觀遺傳酶，因此最小化對(duì)細(xì)胞代謝的意外影響。此外，CRISPR/ dCas9-R2系統(tǒng)的編輯窗口在目標(biāo)位點(diǎn)附近距離約為100bp，并且可能比目前的CRISPR/ dCas9-TET1系統(tǒng)，在距離目標(biāo)位點(diǎn)100-300bp的區(qū)域內(nèi)有效。此外，與系統(tǒng)構(gòu)造中具有挑戰(zhàn)性的其他方法（如ZFs4和TALEs5）相比，CRISPR/ dCas9-R2系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)也得到了總結(jié)。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41421-019-0090-1