CRISPR-Cas系統(tǒng)作為細菌和古菌抵御外源病毒入侵的適應性免疫系統(tǒng)，因其核酸酶和可編程靶向的特點被開發(fā)成基因編輯工具并廣泛應用。然而，天然的CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a等基因編輯工具存在著體內無法在“時間”和“空間”上被精確控制應用的限制，因此研究者們?yōu)榱私鉀Q這一問題，開發(fā)了一系列外源性、可誘導型的CRISPR-Cas基因編輯工具，例如通過藍光和小分子藥物對體內的CRISPR-Cas系統(tǒng)進行“開(on)和關(off)”。但是，這些調控機制都是通過引入外源信號對內源性CRISPR系統(tǒng)進行調控，存在著誘導性差、精確度低等缺點，因此如何開發(fā)細胞內源信號調控的CRISPR-Cas系統(tǒng)十分重要。RNA甲基化作為細胞內表觀遺傳調控的主要途徑之一，是細胞增殖以及調控胞內蛋白-RNA相互作用的主要手段。而N6-腺苷酸甲基化(m6A)和N1-腺苷酸甲基化(m1A)作為RNA甲基化修飾中可被去甲基化的兩種修飾為我們通過體內調控gRNA從而實現(xiàn)針對整個CRISPR-Cas系統(tǒng)的精準調控帶來了希望。

清華大學化學系張新榮課題組、張四純課題組與清華大學生命科學學院劉俊杰課題組合作在《化學科學》(Chemical Science)雜志發(fā)表了題目為“基于引導RNA甲基化與去甲基化調控CRISPR-Cas12a系統(tǒng)。(Regulation of the CRISPR-Cas12a system by methylation and demethylation of guide RNA)”的研究論文。該研究首次發(fā)現(xiàn)針對CRISPR-Cas12a系統(tǒng)gRNA 的5’端核苷酸進行m6A和m1A修飾可以顯著的降低該系統(tǒng)的體外順式(cis-)和反式(trans-)切割活性，并通過EMSA實驗進一步驗證經過修飾的gRNA與Cas12a蛋白的結合能力減弱，最終導致其切割活性降低。隨后，作者通過體外加入去甲基化酶和體內過表達去甲基化酶分別成功實現(xiàn)甲基化修飾gRNA相關的CRISPR-Cas12a系統(tǒng)切割活性的重激活，證明該設計的可行性。最終，作者設計出基于甲基化修飾的誘導型CRISPR-dCas12a基因轉錄調控策略(demethylase-inducible CRISPR activation strategy，DICa)，并成功實現(xiàn)了細胞內由去甲基化酶嚴格誘導控制的CRISPR基因表達激活。該研究為體內嚴格控制CRISPR-Cas系統(tǒng)提供了新的思路，進一步提高了基因編輯療法的安全性和可控性。

圖1. 基于甲基化修飾的誘導型CRISPR-Cas12a系統(tǒng)設計示意圖

清華大學化學系張新榮教授、張四純教授與生命學院劉俊杰助理教授為本文的共同通訊作者。清華大學化學系已畢業(yè)博士生胡志安，清華大學生命學院博士生孫奧為本文共同第一作者，共同承擔設計和進行實驗。其他化學系同學協(xié)助課題的完成。