編輯本段細(xì)胞原代培養(yǎng)

　　一、原理 　　將動物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培 　　養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。 　　二、儀器、材料及試劑 　　儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37℃），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計(jì)數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱（37℃） 　　材料：胎鼠或新生鼠 　　試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒 　　三、操作步驟 　　（一）胰酶消化法 　　1、器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶 　　入超凈臺內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。 　　2、用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。 　　3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1mm2），再用Hank’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。 　　4、視組織塊量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。 　　5、加入3—5ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。 　　6、靜置5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。 　　7、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。 　　8、加入Hank’s液5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。 　　9、加入培養(yǎng)液l—2 ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 　　10、將細(xì)胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。 　　上述消化分離的方法是最基本的方法，在該方法的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步分離不同細(xì)胞。細(xì)胞分離的方法各實(shí)驗(yàn)室不同，所采用的消化酶也不相同（如 　　膠原酶，透明質(zhì)酶等）。 　?。ǘ┙M織塊直接培養(yǎng)法 　　自上方法第3步后，將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入37℃靜置3—5小時，輕 　　輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。 　　四、注意事項(xiàng) 　　1、自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行。 　　2、在超凈臺中，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。 　　3、凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細(xì)菌落入。 　　五、無菌操作的幾個注意事項(xiàng) 　　1、操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。 　　2、點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過 　　營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。 　　3、操作動作要準(zhǔn)確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機(jī)會。 　　4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。 　　5、瓶子開口后要盡量保持45°斜位。 　　6、吸溶液的吸管等不能混用。 　　附：Hank’s液配方： 　　KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml 　　注：Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。

編輯本段基本介紹

　　原代培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng)，嚴(yán)格地說即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，但實(shí)際上，通常把第一代 至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時，細(xì)胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。克隆形成率即細(xì)胞群被稀釋分散成單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時，形成細(xì)胞小群（克?。┑陌俜?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實(shí)驗(yàn)對象。

編輯本段分類

　　最常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。 組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)。 　　分散細(xì)胞培養(yǎng)則是將組織塊用機(jī)械法或化學(xué)法使細(xì)胞分散。如欲從胎兒或新生兒的組織分離到活性最好的游離細(xì)胞，經(jīng)典的方法是用蛋白水解酶（如胰蛋白酶和膠原酶）消化細(xì)胞間的結(jié)合物，或用金屬離子螯合劑（如EDTA）除去細(xì)胞互相粘著所依賴的Ca2+，再經(jīng)機(jī)械輕度振蕩，使之成為單細(xì)胞。

編輯本段實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/SPAN>

　　能獨(dú)立地進(jìn)行細(xì)胞的原代培養(yǎng)，爭取原代培養(yǎng)一次成功。

實(shí)驗(yàn)原理

　　細(xì)胞培養(yǎng)是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究最常用的手段之一，可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩種。原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由于細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段，同時也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。利用此方法還可直接服務(wù)于臨床實(shí)踐。例如，用從手術(shù)中切除的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后用該培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗癌藥物的篩選，根據(jù)腫瘤細(xì)胞對加入的化療藥物的敏感性來幫助選擇最有效的化療方案，有可能起到增強(qiáng)療效、降低副作用的作用。原代培養(yǎng)可分為消化法和組織塊培養(yǎng)法，這里統(tǒng)一作介紹。

實(shí)驗(yàn)材料和用品

　　材料：培養(yǎng)瓶，青霉素瓶，小玻璃漏斗，三角燒瓶，平皿，吸管，試管，移液管，無菌紗布，無菌眼科剪，廢液缸，血球計(jì)數(shù)板，蠟盤，手術(shù)器械，大頭針，離心管。孕鼠或新生1。4d乳鼠，75%酒精棉球，2%碘酒。 　　藥品：培養(yǎng)基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清，0．125%胰蛋白酶，Hanks液，75%酒精，雙抗(青霉素和鏈霉素)。 　　儀器(請參看儀器圖庫)：CO2培養(yǎng)箱．；倒置顯微鏡，超凈臺，磁力攪拌器，離心機(jī)。

  

原代培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)步驟

　　1．取材(以胚胎小鼠為例)：將孕鼠拉頸椎處死，投入75%酒精浸泡數(shù)秒消毒，提出孕鼠控掉酒精，放置于蠟盤中用大頭針固定。用手術(shù)器械逐層分離皮膚和肌肉組織，打開腹腔。注意不同的解剖層次使用不同的消毒器械。最后取出雙角子宮置于無菌平皿內(nèi)。 　　2．用Hanks液洗滌3次，剪開子宮取出胚胎。除去子宮、血液和筋膜等組織。 　　3．用彎頭剪把胚胎盡量剪碎，每個組織塊小于1mm3。在操作時應(yīng)盡量將平皿蓋半蓋住平皿以防空氣中塵埃落下污染組織。再用Hanks液洗滌2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。以下可按兩種方法進(jìn)行，即消化法和組織塊培養(yǎng)法。 　　4．若使用消化法，則將組織塊放人三角燒瓶內(nèi)加入10—30mL0．125%胰蛋白酶，37℃磁力攪拌消化20多min。然后加人少量血清終止消化。用幾層無菌紗布過濾。取過濾液，800r/min離心5－10min收集細(xì)胞。棄上清，加入帶有雙抗的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。 5．若進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，則不做步驟4，加入幾滴血清于組織塊中，再用彎頭吸管將組織塊懸液吸起。在一小培養(yǎng)瓶中逐個鋪展開，注意將瓶底涂抹均勻。將瓶子翻轉(zhuǎn)倒置后在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置2－3h。待組織塊微干與瓶壁粘牢后再輕輕將瓶子翻轉(zhuǎn)過來，從邊角加入4－5mL培養(yǎng)基，使細(xì)胞接觸到培養(yǎng)基，放培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

編輯本段操作要領(lǐng)

混勻操作要領(lǐng)

　　（1）火焰消毒吸管，用Hanks液冷卻和濕潤管內(nèi)壁（這是因?yàn)閯偡蛛x的組織細(xì)胞易粘在管壁上） 　?。?）吸管頭插入管底 　　（3）用吸管反復(fù)輕輕吹打組織塊

器械的使用

　?。?）用工作臺消毒鑷子取浸泡在酒精中消毒的器械。 　?。?）器械置無菌干紗布內(nèi)嚓一下。迅速通過火焰，冷卻后使用。 　　（3）用過的器械置另一加蓋的器皿中再消毒。 　　（4）器械按浸泡消毒的順序使用。 （5）各套再消毒器械不可混用。

除去組織塊多余水分

　　用吸管將組織塊推向青霉素瓶一角，然后將有組織塊的瓶面翻向上方，吸去流向?qū)?cè)的多余水分。 　　注意：多余水分若不除去，會使組織塊剪切不細(xì)，消化后的細(xì)胞懸液清亮（細(xì)胞數(shù)少），并可見消化液中消化液中有線狀或絮狀物漂浮。

細(xì)胞計(jì)數(shù)

　?。?）用吸管混勻待計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液。 　　（2）將一小滴細(xì)胞懸液從蓋玻片與載玻片交界部位滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)池中。 　?。?）沉降1分鐘，低倍鏡下計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板四大中格的結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞，小細(xì)胞團(tuán)計(jì)數(shù)為1。 　　（4）計(jì)數(shù)時，如果細(xì)胞壓在格上，則數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。然后按下式計(jì)算出每毫升懸液中的細(xì)胞數(shù)。 　?。ㄋ拇笾懈窦?xì)胞數(shù)/4）*10000=細(xì)胞數(shù)/毫升

編輯本段注意事項(xiàng)

　　一、注意污染 　　1、嚴(yán)格進(jìn)行動物皮膚消毒，使用三套器械取材。新生動物皮膚先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%~5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。 　　2、嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，防止細(xì)菌、霉菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。 　　3、吸取液體前，瓶口和吸管進(jìn)行火焰消毒；吸取液體時，避免瓶口和吸管碰撞。 　　4、離心管入臺前，管口、管壁應(yīng)消毒。 　　5、實(shí)驗(yàn)者離開超凈臺時，要隨時用肘部關(guān)閉工作窗。 　　6、使用過的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一個器皿中繼續(xù)消毒，在浸泡器械時剪刀口要叉開放，鑷子彎頭要向下放，并加蓋消毒。 　　二、器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止?fàn)C傷、燙死細(xì)胞。經(jīng)火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷卻。 　　三、超凈臺內(nèi)溫度、濕度較大，在夏天工作時臺內(nèi)散熱更慢，因此進(jìn)行細(xì)胞懸液混勻、接種時，離火焰要稍微遠(yuǎn)些。