1. 胰酶消化法(1) 器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘(時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi))再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)(或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi))解剖取肝臟，置平皿中。 (2) 用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。 130 (3) 用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊(1mm2)，再用Hank’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。 (4) 視組織塊量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。 (5) 加入3—5ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制劑)。 (6) 靜置5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。 (7) 1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。 (8) 加入Hank’s液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。 (9) 加入培養(yǎng)液l—2 ml(視細胞量)，血球計數(shù)板計數(shù)。 (10) 將細胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。 上述消化分離的方法是最基本的方法，在該方法的基礎(chǔ)上，可進一步分離不同細胞。細胞分離的方法各實驗室不同，所采用的消化酶也不相同(如膠原酶，透明質(zhì)酶等)。 2. 組織塊直接培養(yǎng)法自上方法第3步后，將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入37℃靜置3—5小時，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中(勿使組織漂起)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。 3. 貼壁細胞傳代方法(1) 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。 (2) 加入1-2 mL 0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準)靜置2-10min(顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測) 。 (3) 吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。 (4) 吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。 (5) 吸取細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。 (6) 加適量新鮮培養(yǎng)液于新培養(yǎng)瓶內(nèi)。 (7) 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
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