核酸分子學(xué)基礎(chǔ)

第一節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)

一、核酸的化學(xué)組成

組成核酸的元素有C、H、O、N、P等，其中N含量約為15~16%，磷含量為9~10%。由于核酸分子中的磷含量比較恒定，因此，核酸定量測(cè)定的經(jīng)典方法則以測(cè)定磷含量來(lái)代表核酸量。

核酸經(jīng)水解可得到很多聚核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本單位，核酸就是由很多單核苷酸聚合形成的多聚核苷酸，核苷酸可被水解產(chǎn)生核苷和磷酸，核苷還可進(jìn)一步水解，產(chǎn)生戊糖和含氮堿。因此，核酸是由含氮堿、戊糖及磷酸三種成分組成。

含氮堿（簡(jiǎn)稱堿基）：核酸中的含氮堿簡(jiǎn)稱堿基，是嘌呤堿（purine）與嘧啶堿（pyrimidine）的衍生物。RNA和DNA含有的共同堿基成分是腺嘌呤（adenine，A）、鳥(niǎo)嘌呤（guanine，G）和胞嘧啶（cytosine，C）。二者的區(qū)別是RNA含有尿嘧啶（uracil，U），而DNA含有胸腺嘧啶（thymine，T）。嘌呤和嘧啶都有酮-烯醇式互變異構(gòu)現(xiàn)象，一般生理pH條件下呈酮式。

有些核酸中含有修飾堿基（或稀有堿基），這些堿基大多是在上述嘌呤或嘧啶堿的不同部位甲基化（methyl合tion）或進(jìn)行其它的化學(xué)修飾而形成的衍生物。例如有些DNA分子中含有5-甲基胞嘧啶（m⁵C），5羥甲基胞嘧啶（hm⁵C）。某些RNA分子中含有1-甲基腺嘌呤（m¹A）、2，2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤（m2 2G）和5，6-二氫尿嘧啶（DHU）等。

嘌呤堿和嘧啶一般多不易溶于水，對(duì)250~280納米（nm）波長(zhǎng)的紫外光有較強(qiáng)的吸收，但對(duì)260納米光波的吸收能力最大。由于堿基是核酸的基本組成成分，因此，所有的核酸（包括DNA和RNA）其共同特點(diǎn)是對(duì)260納米處的紫外光有最大的吸收值。

核酸分子中堿基的克分子數(shù)與磷的克原子數(shù)相等，所以可根據(jù)核酸溶液中的磷含量及紫外光的吸收值來(lái)測(cè)定核酸蜇。一般以每升核酸溶液中含lg磷原子為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算核酸的吸光率，這稱為克原子磷吸光率或克原子磷消光系數(shù)[ε，（p）]，ε（p）的計(jì)算式為：

ε（p）=A/Cl

A為吸光度（光密度），l為比色杯內(nèi)徑，通常為1.0cm；C為每升核酸溶液中磷的克原子數(shù)。

C＝每升溶液中磷重（wg） /30.98

∴ε（p）=30.98A/wl

一般DNA的ε（p）6000-8000； RNA為7000-10000

現(xiàn)將DNA和RNA的化學(xué)組成歸納如表1。

表1 DNA和RNA的化學(xué)組成

二、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)

核酸又稱多聚核苷酸，組成DNA的脫氧核糖核苷酸主要為四種，即dAMP、dGMP、dCMP及dTMP；組成RNA的核糖核苷酸主要有AMP、GMP、CMP及UMP四種。對(duì)兩種核酸的組成可簡(jiǎn)寫(xiě)如下：

DNA=（堿基-脫氧核糖-磷酸）n；RNA=（堿基—核糖—磷酸）n

核酸中核苷酸的連接方式為：一個(gè)核苷酸C-3'上羥基與下一個(gè)核背酸C-5'連接的磷酸基脫水縮合成3'，5磷酸二酯鍵，若干個(gè)核苷酸間依3'，5'磷酸二酯鍵連接成長(zhǎng)鏈的大分子即為核酸。此長(zhǎng)鏈稱多核苷酸鏈，在鏈的一末端核苷酸，其C-5'連接的磷酸只一個(gè)酯鍵，稱此核苷酸為鏈的5'磷酸末端或5'端。鏈的另一端核苷酸上C-3'上羥基是自由的，對(duì)此核苷酸稱為3'羥基末端或3'端，鏈內(nèi)的核苷酸在C-5'上磷酸已形成二酯鍵，C-3'上羥基也已參與二酯鍵的形成，故稱核苷酸殘基。

核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指其核苷酸鏈中核苷酸的排列順序，由于核酸中核苷酸彼此之間的差別仍在于堿基部分，故核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)即指核酸分子中堿基的排列順序。

對(duì)核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的描述為：將5'磷酸末端書(shū)于左側(cè)，中間部分為核苷酸殘基，3＇經(jīng)基末端書(shū)于右側(cè)。通常用豎線表示核糖，堿基標(biāo)于豎線上端，豎線間有含P的斜線，代表3'，5'磷酸二酯鍵。

三、核酸的高級(jí)結(jié)構(gòu)

核酸的多核苷酸鏈在次級(jí)鍵的基礎(chǔ)上，還可形成更為復(fù)雜的二級(jí)及三級(jí)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。

（一）DNA

1.二級(jí)結(jié)構(gòu)

1953年Watson及Crick化學(xué)分析及X線衍射法觀察DNA結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型（double helix model），此結(jié)構(gòu)是在核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的更為復(fù)雜的高級(jí)結(jié)構(gòu)，即DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

（1）DNA雙螺旋

DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)即雙螺旋結(jié)構(gòu)，其內(nèi)容可歸納為：

1）DNA分子為二條多核苷酸鏈以一共同軸為中心，盤(pán)繞成右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋直徑2納米。螺旋盤(pán)繞形成鏈間的兩種溝，即寬的大溝與狹窄的小溝。

2）二條多核苷酸鏈的走向相反，通常取左側(cè)鏈從上到下為5'-3'端，右側(cè)鏈從下向上為5'-3'端，這祥二條鏈構(gòu)成反平行排列的雙螺旋。

3）二條多核苷酸鏈借氫鍵而聯(lián)系在一起。氫鍵乃一鏈堿基上-N壓的氫與另一鏈上堿基的氧或氮形成。堿基間形成氫鍵總是發(fā)生在A與T、G與C之間，A與T間有二個(gè)氫鍵，G與C之間有三個(gè)氫鍵。這種相配關(guān)系稱為堿基互補(bǔ)或堿基配對(duì)。配對(duì)的堿基處于同一平面，此平面與雙螺旋的中心軸垂直，由于二條鏈中堿基互補(bǔ)，所以二鏈彼此又稱為互補(bǔ)鏈。

4）堿基對(duì)之間氫鏈的能量為3~7kcal/mol，由于氫鍵多，所以可維系DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。另外堿基對(duì)彼此間距離為0.34納米，每一螺旋含10個(gè)堿基對(duì)，故螺距為3.4納米，相鄰堿基對(duì)間彼此尚有范德瓦士（van der Waals）力作用（此力能量為1~2kcal/mol，作用范圍為0.5納米），能最雖弱但由于堿基對(duì)多，合力也就大。可見(jiàn)堿基對(duì)的氫鍵及堿基對(duì)之間的范德瓦士力是穩(wěn)定DNA成雙螺旋結(jié)構(gòu)的主要能量。

上述DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)是溶液及活體中常見(jiàn)的形式，通稱B型。當(dāng)B型所處條件的濕度低于75％時(shí)，可轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>A型。A型的堿基對(duì)不垂直于雙螺旋的軸、傾斜約20度，螺距降為2.8納米，每一螺旋含11個(gè)堿基對(duì)。B型與A型的水合程度不同，它們是DNA分子在天然條件下的兩種基本形式。B-A的轉(zhuǎn)換可能具有某種生物學(xué)意義。除A、B型外尚發(fā)現(xiàn)有C、D、E型雙螺旋。

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)闡明的最重要意義在于第一次提出了遺傳信息是以DNA分子中核苷酸的排列順序?yàn)閮?chǔ)存方式，從而說(shuō)明了天然遺傳信息的復(fù)制過(guò)程。

1979年Rich發(fā)現(xiàn)一種相反走向的雙螺旋，即左手螺旋，因其中C與P原子邊接線呈鋸齒形，所以又稱Z-DNA（Zig-ZagDNA）。分析Z-DNA抗體結(jié)合區(qū)域的DNA，發(fā)現(xiàn)有些是增強(qiáng)子部位，說(shuō)明Z-DNA可增強(qiáng)某些基因轉(zhuǎn)錄，但另一些Z-DNA區(qū)域的存在則抑制鄰近基因的開(kāi)放。此外，Z-DNA還有助于負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)的打開(kāi)，一些特異的洞節(jié)蛋白可與之結(jié)合。因此，公認(rèn)Z-DNA與基因的調(diào)控有關(guān)。

⑵三股螺旋DNA（tsDNA）

tsDNA結(jié)構(gòu)是在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成的，三條鏈均為同型嘌呤（homopurine，HPu）或同型嘧啶（homopyrimidine，Hpy），即整段的堿基均為嘌呤或嘧啶。根據(jù)三連組成和相對(duì)位置分兩型。Pu代表嘌呤鏈，Py代表嘧啶鏈。Pu-Pu-Py型，在堿性介質(zhì)中穩(wěn)定。Py-Pu-Py型較多見(jiàn)，在偏酸性pH中穩(wěn)定，其中兩條鏈為正常雙螺旋，第三條嘧啶位于雙螺旋的大溝中，它與Pu鏈的方向一致，并隨雙螺旋結(jié)構(gòu)一起旋轉(zhuǎn)。三鏈中堿基配對(duì)，符合Hoogsteen模型即第三堿基以A-T，G-C（第三位上的“C”必須質(zhì)子化），與G配對(duì)只形成氫鍵。在Pu-Pu-Pu型中存在C-G-G，T=A=A配對(duì)。當(dāng)DNA雙鏈中含H-回文序列時(shí)，即某區(qū)段DNA兩條鏈分別為Hpu和Hpy，并且各自為回文結(jié)構(gòu)時(shí)，任一條回文結(jié)構(gòu)的5'或3'部分都可以形成分子內(nèi)三股螺旋結(jié)構(gòu)，剩余的半條回文結(jié)構(gòu)游離成單鏈。在一定條件下，含H—回文序列DNA還可形成小瘤DNA（noduleDNA），它在中性溶液中穩(wěn)定。

三股螺旋DNA研究意義：①有助于認(rèn)識(shí)染色體結(jié)構(gòu)及真核基因轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、調(diào)控和重組的機(jī)理。②單鏈DNA片段可將切割劑（如內(nèi)切酶，EDTA-Fe等）攜帶至DNA的特定位點(diǎn)，從而達(dá)到選擇性切斷染色體DNA的目的。③寡聚DNA片段封閉轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，達(dá)到關(guān)閉有害基因或病毒基因的目的。④豐富了DNA結(jié)構(gòu)學(xué)說(shuō)。

⑶四螺旋DNA

1）四螺旋的結(jié)構(gòu)：對(duì)d（G4T4G4）X-射線單晶結(jié)構(gòu)解析和H-納米R研究證實(shí)，在四螺旋結(jié)構(gòu)中，四個(gè)堿基G通過(guò)Hoogsteen氫鍵彼此配對(duì)形成一個(gè)四堿基體。在K⁺、Mg²⁺和精胺等存在下，G-四堿基體堆積形成一個(gè)右手螺旋，螺旋每圈含13個(gè)四堿基體，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中在四堿基體中，四條鏈以對(duì)稱和反對(duì)稱構(gòu)象交替存在；在鈉鹽溶液中，形成一對(duì)稱的雙分子四螺旋DNA，其結(jié)構(gòu)單元G-四堿基基體則是以對(duì)稱-對(duì)稱-反對(duì)稱形式存在。

2）四螺旋DNA的生物學(xué)意義：發(fā)現(xiàn)在真核染色體末端存在一個(gè)由DNA和DNA結(jié)合蛋白組成的專一性核蛋白復(fù)合物（稱為調(diào)聚物），它起著穩(wěn)定染色體的作用。在調(diào)聚序列的真正末端含有一個(gè)富含G的單鏈DNA尾巴。它在體內(nèi)的直螺旋應(yīng)力作用下，可自身回折形成HoogsteenG-G堿基對(duì)。兩個(gè)DNA分子或染色體分子可彼此連接起來(lái)形成一個(gè)局部的四螺旋結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可能起著穩(wěn)定染色體和在復(fù)制過(guò)程中保持其完整性的作用。

2.三級(jí)結(jié)構(gòu)

已發(fā)現(xiàn)線粒體、葉綠體、細(xì)菌、質(zhì)粒及一些病毒的DNA雙螺旋分子可形成封閉環(huán)狀，天然狀態(tài)的環(huán)狀DNA分子多扭成麻花狀的超螺旋結(jié)構(gòu)（superhelix），這些比螺旋更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)即DNA分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

真核生物細(xì)胞核中的DNA有一種超螺旋結(jié)構(gòu)，即DNA雙螺旋盤(pán)繞在組蛋白上形成核小體（nucleosome）。核小體染色質(zhì)（chromatin）的核心小粒，由有140個(gè)堿基對(duì)的雙螺旋DNA纏繞于由組蛋白（H2A、H2B、H3及H4各二分子）組成的八聚體外面，這一DNA股由此形成直徑為9納米的超螺旋1.75圈。此核小體又經(jīng)60個(gè)堿基對(duì)的DNA雙螺旋及組蛋白Hl形成細(xì)絲（間隔區(qū)）與下一個(gè)核小體相連接。

核小體的DNA雙螺旋為200個(gè)堿基對(duì)，長(zhǎng)度為0.34mn×200=68納米，但實(shí)際長(zhǎng)度只有10納米，說(shuō)明DNA雙螺旋鏈進(jìn)一步螺旋化盤(pán)繞在組蛋白八聚體上，其長(zhǎng)度應(yīng)壓縮了?。每6個(gè)核小體又繞成一圈形成螺線管，外徑為30納米，螺距為10納米。這樣DNA分子長(zhǎng)度被壓縮了6/7。120個(gè)螺線管又盤(pán)繞成直徑為400納米，高為30納米的超螺線管，DNA分子長(zhǎng)度又被壓縮了40/41，此超螺線管即染色體的單位纖維（unit fiber），長(zhǎng)20~60mn。從單位纖維形成染色體（chromatid），實(shí)際長(zhǎng)度為2~10納米，DNA分子長(zhǎng)度又被壓縮了5/6~6/7。這樣從許多核小體組成的串珠樣纖維經(jīng)多層次螺旋化結(jié)構(gòu)到形成染色單體，DNA分子的長(zhǎng)度已被壓縮至近1/10000。

準(zhǔn)備存于DNA分子中的遺傳信息在表達(dá)以前必須先以RNA的形式復(fù)制出來(lái)，這一過(guò)程稱為轉(zhuǎn)錄。RNA在遺傳信息的傳遞方面起著承上啟下的中心作用。RNA可分為信息RNA（mRNA）核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）。mRNA代謝較快，有的僅存在lmin。rRNA和tRNA則較穩(wěn)定。rRNA和tRNA雖不能翻譯成蛋白質(zhì)，但參與蛋白質(zhì)的合成。rRNA是構(gòu)成核糖體的骨架，在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，核糖體與mRNA結(jié)合并沿mRNA分子移動(dòng)，邊移動(dòng)邊合成多膚鏈。rRNA占細(xì)胞RNA總量的80%，蛋白質(zhì)量的10％左右。tRNA約占全部RNA的50%，在蛋白質(zhì)合成中具有轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用。mRNA是以DNA為模板合成的omRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，每一種多膚都有一種特定的mRNA負(fù)責(zé)編碼，所以細(xì)胞內(nèi)mRNA的種類(lèi)很多。

（二）RNA

RNA分子也是由核苷酸依3'，5'磷酸二酯鍵形成的多核苷酸鏈。RNA總是以單鏈的形式存在，也有5'磷末端及3'羥基末端。RNA單鏈的局部折疊成的某一片段的A及G分別與另一片段的U及C配對(duì)常形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin structure）。在此結(jié)構(gòu)內(nèi)的堿基無(wú)需全部配對(duì)，而配對(duì)部位形成小的雙螺旋區(qū)域，不能配對(duì)的堿基則連成小環(huán)從螺旋區(qū)中被圈出來(lái)。這種RNA單鏈局部小雙螺旋結(jié)構(gòu)即是RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

四、基因組

由于DNA分子中核苷酸序列分析以及一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的研究，使得人們有可能進(jìn)一步了解DNA一般結(jié)構(gòu)與基因組的關(guān)系。已經(jīng)證實(shí)，自然界極大多數(shù)生物體遺傳信息貯存在DNA的核苷酸排列順序中，因此，基因是DNA的一個(gè)片段，只有少數(shù)病毒的遺傳信息貯存在RNA分子中。DNA分子中不同區(qū)域有不同功能，有些區(qū)域可編碼蛋白質(zhì)（最終產(chǎn)物是蛋白質(zhì)），有些區(qū)域可編碼 RNA（最終產(chǎn)物是tRNA和rRNA），有些序列則與調(diào)控有關(guān)。那么一個(gè)DNA分子能攜帶多少基因呢？如果平均1000個(gè)堿基對(duì)可編碼一個(gè)3kD的蛋白質(zhì)計(jì)算，猴病毒（SV40）DNA分子量為3.0×10⁵，有5000堿基對(duì)，可編碼5種蛋白質(zhì)。人染色體DNA有3×10⁹堿基對(duì)，可編碼20萬(wàn)以上的基因，但實(shí)際上，最多可編碼基因數(shù)為2萬(wàn)～3萬(wàn)。這是由于真核細(xì)胞DNA分子除編碼蛋白質(zhì)和RNA等結(jié)構(gòu)基因外，有相當(dāng)部分DNA順序?qū)儆诜蔷幋a區(qū)，而原核細(xì)胞DNA由于分子較小，必需充分利用有限的核苷酸序列。各種生物體內(nèi)DNA分子的大小見(jiàn)表2。

表2 各種生物體內(nèi)DNA分子的大小

1.真核生物的基因組

根據(jù)某一段核苷酸順序在整個(gè)DNA分子中出現(xiàn)的頻率不同可分為以下幾種：

⑴單復(fù)制順序（single copy sequence）：在整個(gè)DNA分子中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。除組蛋白、角蛋白和肌動(dòng)蛋白以外，幾乎所有的蛋白質(zhì)基因都是單復(fù)制順序，平均為1000堿基對(duì)。單拷貝基因在整個(gè)基因組織中所占比例最高。在人的細(xì)胞中約占DNA含量的一半。

⑵中等重復(fù)順序（moderately repetitive sequences）：有些基因如核蛋白體RNA基因、tRNA基因、組蛋白基因等在DNA分子中可重復(fù)出現(xiàn)幾十到幾于次，約占人細(xì)胞DNA含量的30%~40％以rRNA為例，在大腸桿菌中重復(fù)頻率為7而果蠅中可重復(fù)于次?？梢?jiàn)真核細(xì)胞中重復(fù)順序比原核細(xì)胞高得多。

⑶高重復(fù)順序（highlyrepetitivesequences）：可重復(fù)幾百萬(wàn)次。往往是簡(jiǎn)單的重復(fù)順序，如蟹的TA-T-A-T-A-T。也有的較長(zhǎng)如非洲綠猴DNA是以172個(gè)堿基對(duì)的順序?yàn)榛A(chǔ)重復(fù)幾萬(wàn)次。高重復(fù)順序一般位于異染色質(zhì)上，多數(shù)不編碼蛋白質(zhì)或RNA，其功能還不太清楚，主要是起間隔作用，可能與調(diào)控有關(guān)。

在重復(fù)順序中還有一種反轉(zhuǎn)重復(fù)順序（inverted repetitive sequences）。其特點(diǎn)是一段堿基呈現(xiàn)回文結(jié)構(gòu)，即一條單鏈回折即可形成互補(bǔ)的雙鏈，故稱為回文結(jié)構(gòu)（palindromic structure）或發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin structure）。這種結(jié)構(gòu)對(duì)基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄可能具有調(diào)節(jié)控制功能。

5'AAGCTAGCTT 3'

3'TTCGATCGAA 5'→

T······A

C······G

G······C

A······T

5'A······T3'

真核細(xì)胞中單復(fù)制順序和重復(fù)順序常常是間隔排列的。不僅如此，在一個(gè)基因內(nèi)部往往被一個(gè)或幾個(gè)額外的順序分割成若干片段，這種插入到基因內(nèi)部的順序稱為插入順序或內(nèi)含子（intron）。內(nèi)含子是不編碼的順序，而編碼的堿基順序則稱為外顯子（exon）。插入順序是真核細(xì)胞DNA最主要的特征。

真核生物由于存在著較多的重復(fù)順序、特殊的插入順序以及控制區(qū)和其它多余順序，使得DNA總長(zhǎng)度往往入于編碼的結(jié)構(gòu)基因，因此，實(shí)際基因數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于DNA分子。

2.原核生物的基因組

原核生物DNA分子較小，基因組織也較簡(jiǎn)單，一般具有以下特點(diǎn)：

⑴DNA分子絕大部分用于編碼蛋白質(zhì)，不編碼部分（又稱間隔區(qū)）通常包括控制基因表達(dá)的順序。例如，噬菌體φXl74中只有5％是非編碼區(qū)。

⑵功能相關(guān)的基因常常串聯(lián)在一起，并轉(zhuǎn)錄在同一個(gè)mRNA分子中，稱為多順?lè)醋印＿@種現(xiàn)象在真核生物中是很少見(jiàn)的。

⑶基因重疊：例如φXl74的E基因全部包括在D基因內(nèi)，B基因則包括在A基因內(nèi)。這種現(xiàn)象主要發(fā)現(xiàn)在病毒DNA分子中，可能是由于DNA分子太小又要裝入相當(dāng)量的基因的緣故。

第二節(jié)    DNA的變性與復(fù)性

一、DNA變性

DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)，形成單鏈無(wú)規(guī)則線團(tuán)，因而發(fā)生性質(zhì)改變（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等），稱為DNA變性。加熱、改變DNA溶液的pH、或受有機(jī)溶劑（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素的影響，均可使DNA變性。

通常，可利用DNA變性后波長(zhǎng)260納米處紫外吸收的變化追蹤變性過(guò)程。因?yàn)?/span>DNA在260納米處有最大吸收值這一特征是由于含有堿基組成的緣故，在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型中堿基藏于內(nèi)側(cè)，變性時(shí)由于雙螺旋解開(kāi)，于是堿基外露，260納米紫外吸收值因而增加，這一現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)（hyperchromic effect）。

如果升高溫度使DNA變性，以溫度對(duì)紫外吸收作圖，可得到一條曲線，稱為溶解曲線，當(dāng)溫度升高到一定范圍時(shí)，DNA溶液在260納米處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨后即使溫度繼續(xù)升高，其吸光度也無(wú)明顯變化。由此說(shuō)明DNA變性是在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，增色效應(yīng)是爆發(fā)式的。從而說(shuō)明當(dāng)達(dá)到一定溫度時(shí)，DNA雙螺旋兒乎是同時(shí)解開(kāi)的。通常人們把50%DNA分子發(fā)生變性的溫度稱為變性溫度（即熔解曲線中點(diǎn)對(duì)應(yīng)的溫度），由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類(lèi)似，故又稱融點(diǎn)或融解溫度（melting temperature，Tm）。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半時(shí)的溫度。

綜上所述，Tm值和增色效應(yīng)是目前描述DNA特性所常用的兩個(gè)量。假定一個(gè)DNA大分子最初全部是雙螺旋結(jié)構(gòu)，在熱變性后消光系數(shù)上升30％以上；如果DNA原先局部就處于單鏈狀態(tài)（例如在分子末端），則變性后上升較少。增色效應(yīng)的大小是DNA性質(zhì)的一個(gè)簡(jiǎn)單指標(biāo)，與分子量無(wú)關(guān)。Tm不是一個(gè)固定的數(shù)值，它與很多因素有關(guān)：pH、離子強(qiáng)度和DNA的堿基比例。隨著溶劑內(nèi)離子強(qiáng)度上升，Tm值也隨著增大。在某一定離子強(qiáng)度（-10-3mol/L）以下，無(wú)需加熱就使溶于其中的DNA出現(xiàn)不可逆變性。與A-T堿基配對(duì)比較，DNA雙螺旋內(nèi)的G-C配對(duì)更為牢固。在相同條件下，DNA內(nèi)G-C配對(duì)含量高，其Tm值也高。

假定在一個(gè)雙鏈DNA分子內(nèi)某些片段含有較多G-C堿基時(shí)，根據(jù)它們局部Tm值差，用電子顯微鏡就可以觀察和測(cè)量到這些片段。如在DNA某一片段內(nèi)含有較多的A-T堿基時(shí)，在某一個(gè)溫度時(shí)就可能出現(xiàn)雙鏈解離的現(xiàn)象。但在同一溫度下，含G-C對(duì)較多部分仍然保持雙鏈結(jié)構(gòu)。這是一種非常有用的技術(shù)。

DNA的Tm值與以下因素有關(guān)：

⑴DNA的均一性：均-DNA如病毒DNA，解鏈發(fā)生在很窄的范圍內(nèi)，而不均-DNA如動(dòng)物細(xì)胞DNA，其Tm值的范圍則較寬。

⑵DNA分子中（G+C）的含星：一定條件下DNA的Tm值，由G+C含量所決定，因?yàn)?/span>G+C之間有3個(gè)氫鏈，因此G+C含量較高的DNA，Tm值較高，二者的關(guān)系可用以下經(jīng)驗(yàn)式表示。

%（G+C） =（Tm-63.0）×2.44

實(shí)驗(yàn)表明DNA分子中（G+C）克分子含量百分比的大小與Tm值的高低呈直線關(guān)系。

⑶溶劑的性質(zhì)：Tm不僅與DNA本身性質(zhì)有關(guān)，而且與溶液的條件有關(guān)，通常溶液的離子強(qiáng)度較低時(shí)，Tm值較低，融點(diǎn)范圍也較寬，離子強(qiáng)度增高時(shí)，Tm值升高，融點(diǎn)范圍也變窄。因此，DNA制劑不應(yīng)保存在離子強(qiáng)度過(guò)低的溶液中，一般保存在1mol/LNaCl溶液中較穩(wěn)定。

二、DNA復(fù)性

變性DNA只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來(lái)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為復(fù)性（renaturation）。通常DNA熱變性后，將溫度緩慢冷卻，并維持在比Tm低25~30℃左右時(shí)，變性后的單鏈DNA即可恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，因此，這一過(guò)程又叫做退火。復(fù)性后的DNA，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。倘若DNA熱變后快速冷卻，則不能復(fù)性。

影響復(fù)性速度的因素很多，同樣條件下，DNA順序簡(jiǎn)單的分子復(fù)性很快，如polyd[T]和polyd[A]由于彼此互補(bǔ)識(shí)別很快，故能迅速?gòu)?fù)性。但順序較復(fù)雜的DNA分子復(fù)性則較慢。因此通過(guò)變性速率的研究，可以了解DNA順序的復(fù)雜性。DNA片段的大小也影響變性的速率，因?yàn)?/span>DNA片段愈大，擴(kuò)散速度愈低，使DNA線狀單鏈互相發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)的機(jī)會(huì)減少。因此，在復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)將DNA切成小片段，再進(jìn)行復(fù)性。同樣條件下，同一種DNA濃度愈高，復(fù)性速度也愈快。溶液的離子強(qiáng)度對(duì)復(fù)性速度也有影響，通常鹽濃度較高時(shí)，復(fù)性速度較快。

Doty研究小組是最早對(duì)DNA變性過(guò)程進(jìn)行深入研究的。他們獲得的結(jié)果表明，在達(dá)到Tm值時(shí)、兩條DNA單鏈分離開(kāi)。如果在加熱之后慢慢地冷卻，則出現(xiàn)部分復(fù)性，即DNA的一部分回復(fù)到雙螺旋結(jié)構(gòu)。復(fù)性的程度取決于DNA濃度及信息含鼠的多少。病毒DNA（信息含量少）比哺乳動(dòng)物DNA容易復(fù)性，而DNA濃度較高時(shí)，有利于復(fù)性，快速冷卻使DNA仍然處于變性狀態(tài)，這時(shí)自由單鏈成線團(tuán)結(jié)構(gòu)。對(duì)這種情況，人們稱之為螺旋-線團(tuán)轉(zhuǎn)化過(guò)程（helix-coil-transition）?？焖倮鋮s時(shí)消光系數(shù)固然有所下降，但比天然DNA的數(shù)值始終要大。

細(xì)胞核DNA復(fù)性的動(dòng)力學(xué)研究指出，DNA內(nèi)很多片段有重復(fù)的或很相似的堿基順序（所謂重復(fù)DNA）。DNA復(fù)性的程度和過(guò)程與其信息含量多少等有關(guān)；因而病毒DNA比細(xì)菌DNA復(fù)性得快。Britten發(fā)現(xiàn)一種測(cè)定和觀察復(fù)性過(guò)程的方法。X軸表示變性DNA原始濃度（Co）和保溫時(shí)間的乘積，縱軸表示DNA復(fù)性部分（重新作為雙螺旋結(jié)構(gòu)出現(xiàn)）。DNA比例可以用羥基磷灰石柱的辦法加以確定，因?yàn)檫@種柱能夠使單鏈和雙鏈DNA分離開(kāi)來(lái)。DNA復(fù)性曲線呈S形，隨著信息含量增加，此形狀相同曲線往往向高Co.t值處移動(dòng)。奇怪的是，從細(xì)胞核來(lái)的DNA在復(fù)性時(shí)顯示出完全不同的情形：這些DNA中的一部分異?？斓貜?fù)性，而另一些DNA只有在極高的Co.t值時(shí)才出現(xiàn)預(yù)期的復(fù)性。對(duì)快速?gòu)?fù)性可以作這樣的解釋，即在某一DNA之內(nèi)同時(shí)有兒個(gè)相同或很類(lèi)似的順序存在，因而找重復(fù)順序比找DNA內(nèi)唯一順序要快得多。后者含有特殊的遺傳信息，常被稱為獨(dú)特DNA。與之相反是重復(fù)DNA片段。

真核DNA自發(fā)復(fù)性的一種特殊途徑是通過(guò)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。對(duì)單鏈而言，要生成這種發(fā)夾結(jié)構(gòu)，要求一種特定的堿基順序，這種順序稱作回文（正讀反讀都相同）結(jié)構(gòu)。為了構(gòu)成回文結(jié)構(gòu)，DNA片段的堿基順序必須在互補(bǔ)鏈內(nèi)找到相反的順序；在具有相反堿基順序的兩個(gè)DNA片段之間，顯然常常出現(xiàn)短的中間片段。由于存在這樣的核苷酸順序，在復(fù)性時(shí)就能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

如果存在很多重復(fù)回文結(jié)構(gòu)，在部分復(fù)性時(shí)就能通過(guò)形成DNA側(cè)鏈而出現(xiàn)十字形結(jié)構(gòu)。DNA回文結(jié)構(gòu)使DNA片段出現(xiàn)回旋對(duì)稱性。這種結(jié)構(gòu)常常出現(xiàn)在DNA和蛋白質(zhì)之間相互作用的地方，特別是后者起控制作用時(shí)。