〖病理學技術〗免疫電子顯微鏡技術

元亨技術 2025-12-05

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免疫電子顯微鏡技術

第一節(jié) 電子顯微鏡免疫細胞化學技術概述

免疫細胞化學技術為在細胞水平上研究免疫反應做出了貢獻，但由于光學顯微鏡分辨率的限制，不可能從細胞超微結構水平觀察和研究免疫反應。因此，Singer于1959年首先提出用電子密度較高的物質鐵蛋白（ferritin）標記抗體的方法，為在細胞超微結構水平研究抗原抗體反應提供了可能。在此基礎上，相繼發(fā)展了雜交抗體技術、鐵蛋白抗鐵蛋白復合物技術、蛋白A-鐵蛋白標記技術、免疫酶技術及膠體金技術等。

電子顯微鏡免疫細胞化學技術（免疫電鏡技術）區(qū)別于免疫細胞化學和常規(guī)電鏡技術主要在以下幾方面：

一、組織固定與取材

在這方面的要求是既要保存良好的細胞超微結構，又要注意保持組織的抗原性。因此，選用固定劑不宜過強。常用的免疫電鏡固定劑有多聚甲醛-戊二醛混合液和過碳酸-賴氨酸-多聚甲醛液（periodate-lysine-paraformaldehyde，PLP液）。也有采用Bouin液、Zamboni液或4％多聚甲醛液。國外不少文獻推薦應用PLP液于免疫電鏡技術，認為該固定液對含糖類豐富的組織固定效果特佳，因為組織抗原絕大多數(shù)由蛋白質和糖兩部分組成，抗原決定簇位于蛋白部分，有選擇地使糖類固定，就可使抗原性穩(wěn)定。PLP液中過碳酸能氧化糖類，使其產生醛基，再經賴氨酸作用，使新形成的醋基分子間和分子和內相互連接，穩(wěn)定組織抗原。但賴氨酸價格較貴，不如多聚甲醛-戊二醛固定液經濟、簡便、效果佳。在取材方面，免疫電鏡技術較光鏡免疫化學技術要求更迅速、精細。

二、免疫染色

分為包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三種。

（一）包埋前染色

即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應陽性部位取出，修整成小塊，銨常規(guī)電鏡方法處理，經俄酸固定、脫水、包埋。如果特異性免疫反應的范圍太小，為了準確定位，可作第二次包埋，即第一次包埋時將組織置于兩層thermanox塑料片之間，中夾環(huán)氧樹脂如夾心面包式，進行高溫聚合，然后在解剖顯微鏡下取出需要部位作第二次包埋。包埋前染色的組織，以中層較為理想。

表層因受機械修整，結構往往保存不好，深層因抗體不能透入，免疫反應弱或無。在作超薄切片前應先切半薄切片，尋出免疫反應陽性部位。根據作者經驗，半薄切片可在相差顯微鏡下不染色進行觀察（指PAP染色法），免疫反應部位呈黑點狀。在HE或甲苯胺藍色的半薄切片上，免疫反應部位呈棕黃色。據此定位作超薄切片，可大大提高陽性反應檢出率。為避免電鏡鉛、鈾染色反應與免疫反應之間的混淆，可取相連續(xù)的超薄切片，分別以兩個銅網撈取，其中之一進行染色觀察，另一以鈾單染色或不染色進行對照觀察。

包埋前染色法的優(yōu)點是：①切片染色前不經過鋨酸后固定、脫水及樹脂包埋等過程，抗原未被破壞易于獲得良好的免疫反應。②可在免疫反應陽性部位定位作超薄切片，提高電鏡下的檢出率。特別適用于含抗原量較少的組織，但由于經過一系列的免疫染色步驟，常出現(xiàn)一定的超微結構損傷。

（二）包埋后染色

組織標本經過固定、脫水及樹脂包埋、制成超薄切片后，再進行免疫組化染色。由于是以貼在網上的超薄切片進行免疫染色，故又名之載網染色（on grid staining）。必須指出的是：①后固定中是否應用四氧化鋨存在不同意見，作者經驗一般以不用四氧化鋨為佳，或盡橇縮短在四氧化鋨中停留的時間。有作者認為，從理論上講，四氧化俄具有保存抗原的作用，但實踐證明應用四氧化鋨可使抗原活性明顯減低。②在載網染色過程中，銅網易與化學物質產生反應，故需選用鎂網或金網。③在免疫組化處理的全過程中，應注意保持網面的濕潤，網面干燥會影響抗活性。

本法的優(yōu)點是超微結構保存較好，方法簡便，陽性結果有高度的可重復性，還能在同一張切片上進行多重免疫染色。但抗原活性在電鏡生物樣品處理過程中可能減弱甚至喪失；環(huán)氧樹脂中的環(huán)氧基，在聚合過程中可能與組織成分發(fā)生反應而改變抗原性質；包埋在環(huán)氧樹脂中的組織不易進行免疫反應等。因此，免疫組化工作者曾試圖以不同的方法如飽和苯溶液，無水酒精中NaOH飽和溶液或乙氧化鈉溶液等以減少或去除包埋劑，取得不同程度的效果?，F(xiàn)普遍采用的是在進行免疫染色前，以H₂O₂液蝕刻數(shù)分鐘，以去俄和增強樹脂的穿透性。

（三）超薄冰凍切片

銨照Tokuyasu建立的方法，將組織置于2.3mol/L蔗糖液中，以液氮速凍，在冰凍超薄切片機上切片，切片厚度可略厚于常規(guī)樹脂切片。冰凍超薄切片由于不需經固定、脫水、包埋等步驟，直接進行免疫染色，所以抗原性保存較好，兼有包埋前和包埋后染色的優(yōu)點。

三、包埋

（一）樹脂包埋

國內現(xiàn)普遍采用的是環(huán)氧樹脂包埋法，可直接脫水后包埋，也可將小片組織或半薄切片貼在載片上，將充滿環(huán)氧樹脂的明膠囊倒置于切片上聚合、硬化，進行原位包埋。

（二）低溫包埋

常規(guī)樹脂包埋由于需高溫聚合等處理程序，組織抗原性可能全部或部分丟失。因此，在免疫電鏡技術方面，國外不少實驗室已開始采用低溫技術如低溫包埋和冰凍超薄切片等，后者需配備冰凍超薄切片機，且技術難度較大，不如低溫包埋易推廣。低溫包埋劑的研究開始于二十世紀60年代，80年代免疫細胞化學技術在電鏡水平上的廣泛應用，為低溫包埋劑的實驗研究開辟了廣闊的領域。國外已有較多的應用報道，國內一些實驗室已開始摸索。作為低溫包埋劑的多為乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸脂（glycol-ethacrylate，GMA），Lowicryls，LR White和LR Gold等，目前國外生產廠家有Polysciences INC，Reichert-Jung和LKB等系列產品?，F(xiàn)將常用的幾種低溫包埋劑及其應用簡單介紹如下：

1.Lowicryls是丙烯酸鹽（acrylate）和甲基丙烯酸鹽（methacrylate）化學物質，包括K4M、HM20、K11M、KM23等系列產品（Polysciences INC），其特點是能在低溫下保持低粘度（K4M:-35℃；HM20:-70℃；K11M、HM23:-60℃～-80℃）和具有在光照射（紫外光，波長360納米）下聚合的能力，它的光聚合作用與溫度無關。其中K4M和K11M具有親水性，特別適合于免疫細胞化學的應用，因它能較好地保持組織結構和抗原性，減少背景染色。HM20和HM23具疏水性，能產生高反差圖像，適用于扣描、透射電鏡和暗視野觀察切片的制作。所有這些種類的低溫包埋劑都適用于冰凍置換技術。K4M的應用和報道較多，現(xiàn)側重介紹如下：

（1）包埋劑的配制：商品提供的Lowicryls包埋劑由三個部分組成：單體（Monomer），交聯(lián)劑（Crosslinker）和引發(fā)劑（lnitator）。調整單體和交聯(lián)劑的比例，增加交聯(lián)劑的量，組織塊的硬度增加。中等硬度的組織塊，其配制比例如下：

K4M:單體17.30克

交聯(lián)劑2.70克

引發(fā)劑0.10克

K11M:單體 19.00克

交聯(lián)劑l.OOg

引發(fā)劑0.10克

可用微量注射器加針頭抽取后，注入棕色的玻璃容器以避光，用玻棒輕攪3~5分鐘或用一小管通入液氮氣泡以攪拌之。勿過分攪拌，以防氧的氣泡進入包埋劑中。

（2）生物樣品處理程序（Lemanski等1985）

1）動物麻醉取材，以多聚甲醛-賴氨酸-過碘酸鈉在9℃固定2小時。

2）磷酸緩沖液含7％蔗糖，pH7.2，沖洗過夜，0℃

3）0.1mol/L磷酸緩沖液，pH7.2沖洗，0℃。

4）脫水：65％酒精，1小時，0℃。

80％酒精，2小時，-35℃。

Lowicryl K4M:80％酒精（1:1）1小時-35℃。

Lowicryl K4M:80％酒精（2:1）1小時-35℃。

100%Lowicryl K4M 1小時，-35℃。

100% Lowicryl K4M過夜，-35℃。

5）包埋：新鮮K4M置于膠囊內，將組織移入，在-30℃～-40℃以紫外線燈波長360納米 2×15W（Ladd ResearchIndustries Burlington，VT）相距30~40厘米照射24小時使之聚合。如為100W燈泡，照射距離應大于85厘米。聚合后的膠囊移至室溫在紫外線下繼續(xù)照射2~3天，可增加其硬度，便于切片。

（3）免疫染色

1）切片（厚50~70納米）貼在金網或覆有碳膜的鏡網上。所有下列步驟在室溫、濕盒內進行。所有溶液需經微孔濾低（0.25~0.45微米）濾過。

2）正常羊血清30分鐘。

3）第一抗血清（PBS稀釋），37℃ 2小時。

4）可用燒杯法（或塑料壺噴洗法），以鑷夾錦網在第一燒杯中洗蕩30分鐘，然后在第二燒杯中洗蕩1小時。

5）正常羊血清30分鐘。

6）第二抗血清（膠金標記抗體）以正常羊血清稀釋為1:1，以鐫網置于血清滴上孵育1小時。

7）沖洗如④。

8）覆于2% OsO₄水溶液上，30分鐘。

9）沖洗如④。

10）干燥后在電鏡下觀察。

（4）Lowicryl K4M快速包埋染色法（Altman等1984）

l）包埋劑的配制：

單體 13克

交聯(lián)劑 2克

引發(fā)劑 75毫克

2）生物樣品處理：除了聚合這一步驟外，下列所有步驟都在20℃進行。

①組織用3％戊二醛-3％多聚甲醋磷酸緩沖液，pH7.4，在20℃固定1~2小時。用磷酸緩沖液清洗后進行脫水。

②脫水：在50%、75％和90％的雙甲基甲酰胺（Dimethylformarnde，DMF）內系列脫水，每步10分鐘。

③浸透：Lowicryl K4M:DMF（1 :2）10分鐘→LowicrylK4M: DMF（1:1）15分鐘→100%LowicrylK4M 20分鐘→100%Lowicryl K4M 25分鐘

④包埋與聚合：組織移入裝滿K4M的膠囊中，以紫外線燈照射聚合（紫外線燈條件同上，燈和組織距離10厘米，4℃照射45分鐘，組織塊在室溫進行超薄切片（切片時水槽內水面應略低以防浸濕組織塊的切面）。

⑤以覆有碳膜的鏡網撈取切片。

⑥免疫染色

整個包埋時間僅需4~5小時。

Lowicryls應保存在暗處，-4℃，該物質有刺激性，在配制時應戴手套，以免觸及皮膚。在通風櫥內操作，以免蒸氣刺激眼睛。如觸及皮膚和眼睛，應立即以水沖洗局部，氧化重金屬如KMnO₄能與包埋劑作用而影響染色效果，以不用為佳。

2.LR White和LR gold是一種混合的丙烯酸單體的透明樹脂，具有極低的粘度（8 cps）和較強的嗜水性，因此有較強的穿透性，有利于抗體（或抗原）和免疫化學物質穿過LR樹脂，達到組織結合部位。在免疫細胞化學的光鏡（半薄切片）和電鏡水平應用都具有良好效果。標本脫水至70％酒精即可，能較好地保持抗原性。LR White和LRgold在國外提供廠家有PolysciencesINC等，LR gold是一種光引發(fā)低溫聚合的包埋劑，對于免疫細胞化學特別適用，能最大限度地保持組織的抗原與抗體活性，其最佳光聚合溫度在-25℃，在聚合后呈現(xiàn)金黃色，因而得名。LR White可在熱和冷兩種情況下聚合，熱聚合在60℃，24小時，冷聚合在-25℃，需加加速劑（accelerator）調整配制比例。生物樣品處理與免疫染色等同常規(guī)樹脂切片。

3.GMA是乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycol Methacrylate即2-hydroxyethyl methacrylate，HEMA）的縮寫。遠在二十世紀60年代，電鏡工作者就試圖將其作為生物包埋劑應用于光鏡和電鏡。GMA作為電鏡包埋劑的優(yōu)點是電子密度大，影像反差好。但存在三個主要缺點：一是包埋聚合后的組織塊很脆，不易修整和切片。

二是聚合過程中易造成組織損傷如人為的細胞器腫脹。三是缺乏穩(wěn)定性，不能承受電子束的轟擊，包埋劑遇熱升華，造成組織塌陷變形，故后來為環(huán)氧樹脂所取代。聚合后的環(huán)氧樹脂有良好的塑料穩(wěn)定性，能承受電子束的轟擊不變形，而且影像反差好，分辨率高，但其半薄切片染色不夠滿意始終是個有待解決的問題。而GMA包埋切片的染色效果明顯優(yōu)于環(huán)氧樹脂。于是電鏡工作者如Leduc和Bernhard（1968）嘗試以增加一定比例的增塑劑如甲基丙烯酸丁酯（butyl metharylate）和水使之變軟，Spaur和Marlarty（1977）在此基礎上除了加用丁基甲基丙烯酸酯和少量水外，并加入適量的增塑劑如聚乙二醇400（PEG 400）以改變其硬度，加入適量的交聯(lián)劑乙烯二甲基丙烯酸酯（ethylene dimethacrylate）以增強其抗電子束轟擊的穩(wěn)定性。為避免時聚合過快，產生高溫，損傷組織結構，選用低溫型引發(fā)劑--過氧化苯甲酰（Benzoyl Peroxide），溫度范圍-10℃~-30℃。經過不斷的配制改進，現(xiàn)GMA已廣泛應用于半薄切片（1~3微米）的光鏡觀察，特別是組織化學方面的研究和電鏡水平的免疫細胞化學技術。

現(xiàn)將GMA包埋劑的配制、生物樣品處理和電鏡水平的免疫細胞化學染色方法簡介如下：

（1）GMA單體溶液在出廠時都加有氫醌類穩(wěn)定類，用前須以每25毫升單體溶液加一匙活性炭，在振蕩器上振蕩5分鐘，過濾以除去氫醌，以免影響聚合。

a.100%GMA 66.5毫升

N-甲基丙烯酸丁酯 28.5毫升

5％乙烯二甲丙烯酸酯 5.0毫升

1.5％過氧化苯甲酰 l.Og

l.0%PEG400 1.0毫升

b.A液：

GMA單體液 90毫升

PEG400 5~9.4毫升

過氧化苯甲酰 0.2-0.69克

攪拌溶解后置棕色瓶內；4℃保存。

B液：

PEG400 20毫升

二甲基苯胺 1毫升

應用時A:B銨10:1比例充分混合（張承志等1986）。

（2）生物樣品處理：組織固定可用PLP液或1％戊二醛溶液（磷酸緩沖液配制，pH7.4）。經系列酒精脫水至新鮮的GMA單體溶液中浸24小時。以上步驟可在室溫或4℃進行。

（3）包埋聚合：組織移人盛滿包埋液的膠囊內，先放在真空泵內以去除包埋液中的氣泡，然后在4℃，以紫外線燈（波長360納米）在距膠囊底部10~20厘米處進行照射12~16小時以手指捏膠囊、試其硬度可知聚合是否成功。在聚合完成后，將膠囊丟入熱水中以去除膠囊外殼。

（4）切片貼在錦網上，銨PAg技術進行包埋后染色。其區(qū)別于EPON包埋劑者，在于GMA包埋切片染色所需時間較短，在第一抗血清，GMA室溫只需孵育1小時，而EPON包埋切片需16~20小時；在第二抗血清，即PAg復合物中室溫30分鐘，而EPON包埋切片需1小時。鈾、鉛雙染后，電鏡觀察。

低溫包埋劑常用于鐵蛋白或膠體金免疫電鏡技術的包埋后染色。能檢出應用環(huán)氧樹脂包埋難以檢出的多種抗原。

四、對照試驗

為確定方法的特異性，免疫電鏡技術也需進行對照試驗（同第一章）。p344

總之，不論哪一種免疫電鏡技術都面臨微細結構的保存和組織中抗原活性的保存這一對矛盾。如戊二醛、鋨酸等固定液有利于微細結構的保存，但對抗原活性有影響，而H₂O₂能增加樹脂穿透性，但對細微結構有損傷，能使反應部位產生孔洞。在生物樣品處理過程中，應同時注意到這兩個方面。其次，每次免疫染色中的清洗工作應注意徹底，否則非特異性產物和其他污染物會影響特異性反應產物的顯示和觀察。根據作者經驗，以塑料水壺加錐形噴水頭噴洗，與錦網面成平行方向，即順網面噴洗，較之目前通用的杯水洗滌法易于達到清潔目的。沖洗的殘留水滴以濾紙吸干時，應注意不要觸及載網本身。可將濾紙剪成三角形，以尖端接觸水滴，即可達到吸干水分的目的，整個過程中，必須應用雙蒸水，容器應專用。

第二節(jié) 免疫鐵蛋白技術

一、基本原理

鐵蛋白是一種含鐵（約占23%）的蛋白質，分子量460kD，直徑10~12微米?？贵w與鐵蛋白通過低分子量的雙功能試劑結合為一種雙分子復合物。此復合物既保留抗體的免疫活性，同時因為鐵蛋白含有致密的鐵離子核心，鐵膠粒直徑的核心為55-60納米含2000~3000個鐵原子，分布于四個區(qū)域，形成四個圓形致密區(qū)，具有很高的電子密度，便于電鏡觀察。鐵蛋白來自許多動物，以肝、脾含量較高，其中馬脾臟含量最高。因而，商品鐵蛋白主要是從馬脾臟中提取的。

二、鐵蛋白的提取和純化

取健康的馬脾（新鮮或冰存均可），去除脾外的淋巴結和脂肪組織，銨濕重1:1.5或1:2加入蒸餾水，用組織勻漿器將組織勻漿，置水浴中加熱至75~85℃，使鐵蛋白以外的蛋白質變性，冷卻后用2~4層紗布過濾，

濾液離心取上清液，每100毫升上清液中加入硫酸銨35克，充分攪拌使鐵蛋白沉淀析出，4℃過夜，3000~10000轉/分鐘離心20分鐘，棄去上清液，刮取沉淀物置透析袋內，剩余沉淀物以蒸餾水洗后，一并加入透析袋內對水透析，除去硫酸銨。100毫升中加入4~5克硫酸鎬使之結晶，在室溫或4℃冰箱內使之出現(xiàn)鐵蛋白結晶，此鐵蛋白結晶以2％硫酸鐵（pH5.58）溶解后，如上述再用硫酸鎘使之結晶。反復溶解，結晶六次，達到純化。純化后鐵蛋白在半飽和的硫酸銨溶液內可保存1~2年。用時以蒸溜水透析除鹽后即可應用，應用前可以用負染色法在電鏡下觀察，了解鐵蛋白的完整性和純度。

商品制備的鐵蛋白是用2％硫酸鐵溶液稀釋的1～2％溶液（pH5.85）。為了在應用中得到滿意的結果，應用前必須將商品制備的鐵蛋白進一步純化。純化的方法是用0.1mol/LNaOH或0.1mol/L HCl調整pH值至5.85，然后加入20％硫酸鎘溶液使其在鐵蛋白液中最終濃度為5％硫酸鎘，此溶液置于4℃冰箱內2小時（或過夜）至結晶完成，離心1小時（200轉/分鐘）棄上清液。鐵蛋白結晶再溶解，離心除去不溶性顆粒，傾出上清液，加入5％硫酸鎬再結晶，至在顯微鏡下呈棕色紅色鐵蛋白結晶為止。將結晶溶于2％硫酸銨溶液中用硫酸鐵溶液沉淀三次，第三次沉淀形成的沉淀物溶于少量蒸餾水中，先對自來水透析，再對0.05mol/L，pH7.5磷酸緩沖液透析12~24小時。純化的鐵蛋白溶液用100000轉/分鐘超速離心2小時，除去?無色的上清液，沉淀物（內含鐵蛋白）在4℃過夜，待完全融解后，用微孔濾過器（mi11ipore filter，孔徑0.25~0.45微米）過濾，保存1~2年內仍可使用。

三、鐵蛋白與免疫球蛋白的結合

一般用低分子量的雙功能試劑把兩者聯(lián)結起來，常用的雙功能試劑有間苯二甲基二異氮酸鹽（XC）；甲苯2，4二異氮酸鹽（TC）；鄰茜香胺（BDD）；對，二氟-間，間，二硝基二苯砜（簡寫FNPS）和戊二醛。近年來，普遍認為戊二醛作為聯(lián)結劑效果較好，對抗體活性影響小，標記抗體產量高。分為一步法和二步法。現(xiàn)簡介如下：

（一）一步法

以鐵蛋白15毫克和球蛋白3毫克溶于0.1mol/L磷酸緩沖液0.9毫升中，pH7.0，加入0.1毫升新鮮配制的戊二醛溶液，使其最終濃度為0.005~0.05%，加入0.02％疊氮鈉（NaN₃）防腐，此混合液置37℃ 24小時，無需攪拌，結合完畢后加0.01mol/L賴氨酸中止反應。

（二）二步法

1.在含50~80毫克鐵蛋白的0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）中，加入稀釋的戊二醛，使其最終濃度為0.05~0.15%，總體積為1毫升。

2.置37℃作用2小時后，經葡聚糖G-25濾柱，除去未結合的戊二醛。為避免不必要的稀釋，只收集洗脫峰的中間部分。然后加入球蛋白（鐵蛋白與球蛋白之比為5:1）即鐵蛋白最終濃度為15毫克/毫升，球蛋白為3毫克/毫升。

3.混合液置37℃，作用12小時（無需攪拌），加入0.01mol/L的賴氨酸以中止進一步交聯(lián)。兩步反應都需在0.02%NaN₃防腐條件下進行。

四、電鏡標本的制備方法

（一）固定

同常規(guī)電鏡一樣，應用醛類和四氧化俄雙固定，以維持細胞和組織的超微結構。有文獻報告以4％的甲醛溶液在pH7.2的磷酸緩沖液內，在0℃進行固定，并用四氧化鋨作后固定，不會影響抗原的反應能力。高猛酸鉀能使大部分抗原失去活性，一般不宜采用。另外，鐵蛋白標記抗體的特點之一是分子量大。因此，如用于細胞表面抗原的定位研究，可將樣品直接放入固定液，否則需要采取適當?shù)拇胧?，打破細胞膜，增強細胞對標記抗體的通透性，常采取以下方法：

l．凍融法：將小塊組織或細胞經固定后，凍融一次，使細胞膜破裂，標記抗體能進入細胞內。

2.冰凍切片法：固定后組織快速冷凍，切成10~15微米左右薄片，溶化的切片直接浸泡于鐵蛋白標記抗體液中。

3.有報道經戊二醛固定后，浸入4×10^-3mol/L洋地黃皂甙（digitonin）液中1~2分鐘，能有助于增強細胞膜的穿透性，使標記抗體液進入細胞內。

（二）免疫染色

免疫反應處理常用包埋前染色，分直接法和間接法兩種C在染色前，將組織切成約10~20微米厚的薄片。

1.直接法將薄片直接浸泡于標記抗體液中，室溫或37℃作用1~2小時或更長；緩沖液（有人提倡用冷緩沖液）浸漂，除去未結合的標記抗體溶液，然后轉入常規(guī)雙固定和電鏡包埋。

2.間接法

1）將組織切片浸于第一抗體液中，室溫30~60分鐘。

2）以大量冷緩沖液充分攪拌洗滌，至少3次，每次30分鐘。

3）浸入鐵蛋白標記抗體液中，室溫30分鐘。

4）如2），用緩沖液充分洗滌后，可以自然沉淀或用離心方法撈取組織片。

5）將離心沉淀小塊，用四氧化鋨固定30分鐘。

6）常規(guī)電鏡脫水、包埋、切片、染色和觀察。

第三節(jié) 免疫酶細胞化學技術

一、基本原理

免疫酶細胞化學技術是以酶作為抗原抗體反應的標記物，在既不改變抗原抗體的免疫反應特異性也不影響酶活性的條件下，與相應的酶底物作用，形成一種不溶性的反應產物。在光學顯微鏡下觀察時，要求反應的終末產物是不溶性的有色物質，具有可觀察性。在電鏡下觀察時，則要求底物的終末產物具有較高的電子密度。由于辣根過氧化物酶（horse radishperoxidase，HRP）具有穩(wěn)定性強和反應特異性高等優(yōu)點，是目前應用最多的酶標記物。實驗方法包括酶標記抗體法、非標記抗體酶法和非標記的過氧化物酶-抗過氧化物酶技術（PAP法）。

二、電鏡標本制備方法

免疫酶細胞化學技術可用于包埋前和包埋后染色，但以前者應用較多。

（一）單層細胞培養(yǎng)物免疫酶染色法

（1）用4％多聚甲醛（在0.05mol/L磷酸緩沖液中，pH7.2）在原位固定（4℃）1小時。

（2）用0.05mol/LPBS充分冼滌后，用HRP標記的抗體血清作用18小時，再用PBS充分洗滌。

（3）2％戊二醛固定1小時，再水洗。

（4）呈色反應，用DAB-H₂O₂呈色反應，水洗。

（5）1％俄酸后固定30分鐘~1小時，原位用環(huán)氧樹脂包埋，光鏡作半薄切片定位后，作超薄切片。

（二）組織切片酶標記抗體染色法

（1）1毫米厚組織塊，在4℃下用固定液固定后，置于含4.5％的蔗糖PBS（0.05mol/LpH7.2），4℃沖漂洗，換數(shù)次固定液，過夜。

92）隨后，作10~40微米的冰凍切片，放入第一抗體血清作用12~18小時，4℃，用含蔗糖的PBS洗數(shù)次。

（3）置于H即標記抗體液（第二抗體）4℃過夜。然后用含蔗糖PBS反復沖洗數(shù)次。4℃浸漂過夜。

（4）2.5％戊二醛（pH7.4磷酸緩沖液）再固定1小時，4℃用含蔗糖PBS反復沖洗去戊二醛，每次5分鐘，共洗3次。

（5）DAB-H₂O₂顯色15~30分鐘。

（6）0.05mol/LPBS沖洗3次，每次30分鐘，再置于室溫中用1%~2％俄酸固定1小時，脫水、包埋、切片復染和觀察。

（三）PAP包埋前染色法（Pickel等，1975）

經固定組織、應用振動切片機（vibratome）切35~50微米厚片，或用組織鋪片，以漂浮法在反應板上進行下列步驟。

（1）正常羊血清（1:30 PBS稀釋），室溫孵育30分鐘。

（2）第一抗體（A種動物抗血清），4℃濕盒中48~72小時。

（3）羊抗A種動物血清（1:100）室溫30分鐘。

（4）A種動物血清PAP復合物（1:100）室溫30分鐘。

（5）DAB·4HCl/H₂O₂（0.05%/0.01%），室溫15分鐘。上述每一步驟后應用PBS洗滌（5分鐘×3次）。

（6）在解剖顯微鏡下檢出免疫反應陽性部位，修整組織，用0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋的1％鋨酸（pH7.4）后固定30分鐘~1小時。

（7）按常規(guī)電鏡樣品制備，脫水、包埋、超薄切片、染色觀察。

（四）PAP包埋后染色法（Ordronneau，1982）

（1）將載有切片的銀網（或金網）在5％的H₂O₂液中蝕刻（etch）2~3分鐘。生理鹽水沖洗，濾紙吸干。

（2）正常羊血清用0.05mo1/LTris鹽液（TBS）稀釋成1:30，pH7.0，室溫5分鐘。

（3）兔抗血清（第一抗體），內含1％正常羊血清，用0.05mol/L，Tris緩沖液，pH7.6，4℃，48小時后以Tris緩沖液洗滌。

（4）正常羊血清1:30，室溫5分鐘。

（5）羊抗兔1:10（第二抗體，0.05mol/LTris緩沖液稀釋，pH7.0）室溫5分鐘，Tris緩沖液洗滌。

（6）正常羊血清1:30，室溫5分鐘。

（7）兔PAP復合物，內含1％正常羊血清，室溫3分鐘，Tris緩沖液洗滌。

（8）DAB-H₂O₂液顯色（含H₂O₂0.0l~0.03%），室溫3分鐘。

（9）4％的磷酸鹽緩沖的酸溶液10~15分鐘，蒸餾水洗滌（此步用于改善微細結構的反差），電鏡觀察。

（五）PAP免疫電鏡雙重標記

在連續(xù)的超薄切片上進行，用包埋后染色法在相鄰的兩張切片上分別以不同的抗體進行免疫染色?？稍诔⒔Y構水平判定細胞內抗原共存的情況。

第四節(jié) 免疫電鏡膠體金標記法

金標法

Faulk和Taylor（1971）提出，并首先用于免疫電鏡。它是利用膠體金在堿性環(huán)境中帶有負電的性質，使其與抗體相吸附，從而將抗體標記。當用金標記的抗體與抗原反應時，在光鏡水平膠體金液呈現(xiàn)鮮艷的櫻紅色，不需另外進行染色。

在電鏡水平，金顆粒具有很高的電子密度，清晰可辨。因此，免疫電鏡膠體金標記法近年來被成功地應用于生物學的各個方面，并取得了可喜的進展，解決了一些過去未能解決的問題。二十世紀80年代以來似有取代免疫電鏡PAP技術的趨勢。膠體金標記抗體技術在電鏡水平應用有許多優(yōu)點：首先，手續(xù)不如PAP法繁瑣，不需要H₂O₂等損傷微細結構的處理步驟，對微細結構的影響較少。其次，金顆粒具有很高的電子密度，在電鏡下金顆粒清晰可辨，易于與其他免疫產物相區(qū)別。因此，金標法還可以和PAP法相結合進行雙重或多重染色的超微結構定位。另外，利用不同直徑的金顆粒標記不同的抗體，是研究突觸小泡內神經遞質共存的有力工具。由于抗原抗體反應部位結合金顆粒數(shù)量的多少可進行粗略的免疫細胞化學定量研究。金標抗體還可加入培養(yǎng)液中，對培養(yǎng)細胞內抗原進行標記定位。曾有報告用金標記法于細胞內骨架的研究獲滿意的效果。由于金具有強烈的激發(fā)電子的能力，因此，不僅可以用于透射電鏡的超薄切片觀察，也可以用于掃描電鏡對細胞表面的抗原、受體進行標記定位觀察。金標液無毒性，對人體無損傷。在原位分子雜交技術在電鏡水平的應用中，膠體金的標記術被科技工作者認為是當前最理想的標記物。

一、電鏡水平的免疫金染色法

應用于電鏡水平的免疫金染色法，可分為包埋前染色和包埋后染色，由于包埋前染色對細胞膜的穿透性差，一般只用于細胞表面的抗原標記，如需穿透細胞膜，則需輔以凍融法或加入Triton X-100、皂素等活性劑，后者會加重細胞超微結構的破壞，因此，現(xiàn)較普遍采用包埋后染色，現(xiàn)分別介紹如下：

（一）包埋后染色

（1）超薄切片厚50~70納米左右，載于200~300網孔的銖網上。

（2）置1%H2O2內10分鐘至1小時（視樹脂的硬度和切片的厚度而定），以去鋨酸和增進樹脂穿透性，有利抗體進入。如切片很薄或于低溫包埋時，此步可省略。操作時，滴入1%H₂O₂液1滴于蠟板上，將網的載片面輕浮于液滴上。對中樞神經系統(tǒng)切片，有主張以1％過碳酸鉀（KIO4）代替H₂O₂的。

（3）雙蒸水洗3次，每次10分鐘，第1，2次洗法如（2），浮于液滴上，第3次以盛雙蒸水的注射器沿銀網面沖洗，水流應有適當壓力，但不宜過強，用濾紙在網緣將水吸干。

（4）浮于正常羊血清（1：50~1:100）滴上，室溫30~60分鐘，以飽和固定劑中的游離醛基占據非特異性結合部位。

（5）PBS漂洗3分鐘，洗1次（有人主張不洗）。

（6）濾紙吸干，孵育于第一抗體血清滴上，先室溫預孵1小時，再置于4℃24~36小時。

（7）PBS漂洗3分鐘，3次。

（8）PBS（內含1％的牛血清白蛋白，pH8）2中，5分鐘，此步為膠體金結合作準備。

（9）膠體金標記抗體液1:30~1:100，淡紅色為適宜稀釋液，室溫孵育10分鐘至1小時。

（10）雙蒸水洗3分鐘，3次。

如作雙重染色，則應將鏡網翻過來，用另一類抗體血清，重復上述步驟（2）~（10）。

（11）5％醋酸鈾（雙蒸水配制）染5分鐘，然后用雙蒸水洗。

（12）枸櫞酸鈾（或醋酸鉛）染色5分鐘，雙蒸水洗凈。

（13）電鏡觀察。

（二）包埋前染色

（1）組織經過適當固定，為增強細胞穿透性，可在固定液中加入皂角素（saponin），使其濃度為0.01%，經含皂角液固定劑處理5~8分鐘后，應用0.01mol/LPBS pH7.4沖洗12小時左右，中間換洗3~4次。

（2）組織切片貼于明膠涂抹的玻片上，細胞可制成混懸液，用離心法操作或制成涂片。

（3）0.05mol/LTBS pH7.4洗3分鐘。

（4）以1:5正常羊血清處理切片30分鐘室溫，以阻斷非特異性吸附。

（5）第一抗體4℃孵育20小時后室溫2小時或過夜。

（6）0.05mol/LTBS pH7.4洗3分鐘×3。

（7）0.02mol/LTBS pH7.4洗3分鐘×3，為與膠體金結合作準備。

（8）再次阻斷非特異性吸附，同（4）。

（9）以金標記的第二抗體（工作濃度1:40左右）在室溫下孵育1小時。

（10）0.02mol/LTBS pH8.2洗3分鐘。

（11）0.05mol/LTBS pH7.4洗3分鐘×3次。

（12）1％俄酸（0.1mol/LPBS溶液）1小時。

（13）雙蒸水洗15分鐘。

（14）系列酒精或丙酮脫水，包埋、超薄切片。

（15）枸櫞酸鉛對照染色。

為增加抗非特異性染色，有的實驗室傾向在TBS中加入1％小牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，Sigma）。理想的免疫金染色切片，背景應清潔，無殘留的金或其他無機鹽顆粒，金粒集中在抗原、抗體反應部位。

要獲得理想的免疫金染色切片，需注意的因素很多，其中主要的如：①抗體血清的高度特異性和親和力；②被檢組織應有較高濃度的抗原；③沖洗液的清潔度，沖洗的徹底程度以及整個過程中應用的各種器皿的清潔度等。④所有溶液最好用微孔濾過器（milipore filter）濾過，濾膜孔徑0.2~0.45微米，所有器皿應清潔和專用。整個操作過程應在濕盒內進行，以使載網保持濕潤。

二、膠體金標記蛋白A技術（ProteinA-gold，techniquePAg法）

在電鏡水平應用較為廣泛，因該法具有特異性強、靈敏度高、方法簡便和背景染色淡等優(yōu)點。蛋白A的免疫特異性在免疫細胞化學章中已作了介紹，PAg復合物制備方法簡便，作為第二抗體，無種屬特異性，可以免去不同種屬動物要制備不同的特異性免疫球蛋白的麻煩。PAg復合物與包埋劑和細胞成分都極少發(fā)生非特異性的交互作用，蛋白A和金粒間非共價的結合特性既不影響蛋白 A的活性，又能保持高度的穩(wěn)定性，PAg復合物分子最小于穿透組織。

（一）蛋白心金（PAg）復合物的制備（S10t和Geuze，1981） 1．膠體金液的制備，應用枸櫞酸三鈉還原法（見第二十五章）

2.待標記蛋白質和金溶液的準備，同前。注意點是用0.2mol兒K2僅為將金溶液pH調至5.9~6.2之間。

3．確定膠體金與蛋白A的結合用量比例。取一系列盛有0. lrnl膠體金液的小玻璃管，分別加入不同量的蛋白A，5mm后，再各加0.2 ml 10％的NaCl。如加入的蛋白A濃度不夠，不能穩(wěn)住金粒，在電解質NaCl的影響下，金粒聚合沉淀，溶液由紅變藍。選擇能防止溶液由紅變藍的最低濃度的蛋白A的量作為兩者的結合比例。以枸櫞酸鈉法制成的膠體金每毫升約需要5鴻蛋白A業(yè)結合，方能保證其穩(wěn)定性。

4．膠體金與蛋白A的結合和純化，依上法測得所需的比例超過10%，即每30叫膠體金中加入2mg蛋白A，5分鐘后，加入0.3ml PEG作為穩(wěn)定劑，然后以15000轉/分鐘離心45分鐘（不同方法制備的金離心速度不同），略帶紅色的松散的復合物沉淀即為PAg復合物。小心棄去上清液，加入PBS沖洗，如上，松散的PAg復合物置于PBS溶液中，銨0.2mg/rnl的比例加入聚乙二醇作為穩(wěn)定劑，保存于硅化的玻璃皿中備用，也有主張將上述PAg復合物放入3-6ml 5％甘油-0.05％聚乙二醇-0.02％疊氮鈉混合液中，再離心，棄去無色上清液后，收取管底部濃縮純化PAg復合物置4℃保存。

據文獻報告，此PAg復合物的原液在4℃可保存達一年之久。

（二）電鏡水平的PAg染色法

PAg法在電鏡技術的應用原則是二步標記法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要區(qū)別于一般膠體金免疫染色在：O須1％卵白蛋白-PBS（pH7.4）或1％卵白蛋白-0.05mol/LTris緩沖液（pH7.4）來封閉非特異性的結合部位，而不是采用羊或其它的動物的正常抗血清，因為PAg復合物能夠與正常血清中的lg結合，從而給出假陽性結果；＠在應用第一抗血清孵育和PBS沖洗后作第二抗血清即PAg復合物孵育前的準備時，應用的PBS或TBS的pH應變?yōu)?/span>pH7.4。在變更這兩步后，其它可參照本節(jié)中包埋前、后染色法進行。也可采用下列步驟進行包埋后染色。

1.載有超薄片的錦網或金網浮于1％卵白蛋白-PBS液滴上，室溫約5分鐘。

2.載網不沖洗，直接移至第一抗血清液滴上，在室溫孵育2小時或4℃18-24小時。

3.PBS沖洗3分鐘×2次。

4.將PAg原液稀釋10-20倍，載網浮于該液滴上，室溫孵育1小時。

5.PBS沖洗5分鐘×2次。

6.5％醋酸鈾水溶液染色，水洗。

7.枸櫞酸鉛染色。

8.電鏡觀察。

三、膠體金雙標記技術（常用為蛋白A-膠體金）

（一）單面法

以不同直徑的金粒分別標記兩種不同的抗體，以間接法先染第一種抗體，洗凈后再染第二抗體。

（二）雙面法

以不同直徑的金粒標記的抗體于鐫網的兩面分別進行免疫染色。本法的優(yōu)點是可防止兩種金標記的抗體相互干擾，又可防止第一次應用的一抗與其相應的抗原相結合，占據了空間，第二次應用的抗體沒有適合的空間使之與相應的抗原相結合。

（三）異種動物抗原一抗體染色法

如一抗分別用人與兔抗血清，人抗組織抗原A，兔抗組織抗原B。第二抗體分別以不同直徑金粒標記的抗人和抗兔免疫球蛋白。由于種屬不同，兩種抗血清不會互相干擾，在應用一抗和二抗時都可將兩種血清一次混合使用，將四步減少為兩步。

（四）金標記抗原檢查法

此法是Larson（1977年）首先提出的，應用放射性同位索如1251或酶標記抗原進行染色。先用特異性抗體與組織抗原反應，標記的純抗原又與特異性抗體反應。Larson（1980，1981）又在此基礎上提出膠體金在電鏡水平進行雙抗原甚至多抗原定位。金標記抗原檢查法（gold-labe11ed antigen detection method，GLAD法）原理是：雙價的lg抗體分子過量地加到有抗原的組織切片上，使分子的兩個抗原結合點有一個結合到組織抗原上，而另一端可與標記金的抗原起反應。雙標記時，預先將兩種不同的抗原標以不同直徑的金粒，可分別與相應的第一抗體相結合，從而顯示出兩種抗原

在組織切片的定位。此法的優(yōu)點是標記物所顯示出的組織抗原的部位經過兩次選擇，標記了的抗原只能與相應的特異性抗體相結合而不能與切片中非特異性lg相結合，因此具有較高的特異性。但由于使用此法時需備有與欲檢抗原相同的純抗原，并要對不同抗原分別進行標記，非一般實驗室所能做到，所以至今尚未被廣泛應用。

雙面金標記法操作程序（Cai等1993，改良自Bendayan等1982）。

1.銀網面A（樹脂包埋）。

l）蒸餾水沖10分鐘。

2）10%H2O2蝕刻10分鐘室溫

3）10％正常血清（以0.5mol/LTris緩沖液pH7.4含1%BSA和2%Tween20稀釋，簡稱 TBT緩沖液）室溫30分鐘。

4）以濾紙吸去多余液體，覆于特異性第-抗體1: 500（Tris緩沖液，pH7.4含1%BSA和0.1％疊氮鈉）4℃，孵育過夜。

5）徹底清洗，應用0.5mol/LTris緩沖液pH7.2，不含BSA。

6）繼之用0.5mol/LTris緩沖液pH8.2，含1%BSA沖洗。

7）mol/LTris緩沖液pH7.6，含1%BSA，室溫孵15分鐘。

8）羊抗兔lgG標記以15納米金粒，應用0.5mol/LTris緩沖液pH8.2含1%BSA稀釋1:40，孵育2小時，室溫。

9）0.5mol/LTris緩沖液pH7.4沖洗。 10）蒸餾水沖洗。

2．課網面B，重復1）~10），只在第4）時更改另一特異性一抗，在8）時羊抗兔IgG標記以5納米金粒。

3.鈾鉛雙重染色，電鏡觀察，可見二種不同直徑金粒的標記。

注意事項：心所有溶液均須經加有微孔濾紙（0.45微米孔，國內外現(xiàn)均有商品提供）的注射器過濾，過濾后直接以注射器沖洗。＠濾紙最好用無纖維吸水濾紙。＠沖洗在膠金標記技術上是個決定性關鍵，僅次于抗體血清的純度。筆者的體會是一般應漂洗3X5分鐘，以注射器噴水漂洗效果優(yōu)于杯漂洗法，但漂洗水流需與網面平行，勿使水壓破壞切片。

四、免疫電鏡金銀法染色技術

關于免疫金銀細胞化學的原理、試劑配制和光鏡顯示技術在本書光鏡膠體金章己作了較為詳盡的敘述。免疫金銀細胞化學技術亦可應用于電鏡水平。一般用于包埋前染色。其主要操作步驟如下：

1.組織固定振動切片機切片10~30微米。

2.入3％正常羊血清，含0.1% TritonX-100的PBS孵育30分鐘，以封閉非特異性結合部位。

3.1％繃氫化鈉的PBS孵育30分鐘。 4.一抗37℃，2小時。

5.PBS含0.1%BSApH7.4沖洗3分鐘×3次。

6.PBS含0.1%BSApHS.2沖洗3分鐘×3次。

7.入10-15納米金標羊抗兔抗血清，工作濃度約1:10，37℃孵育45分鐘。

8.硝酸銀液物理顯影（詳見第二十五章）。

9.在解剖顯微鏡下取免疫反應陽性部位，入1％俄酸后固定20分鐘，常規(guī)脫水，樹脂包埋。

10.超薄切片機切0.1微米左右半薄切片，定位陽性反應部位，制超薄切片。如有暗視野顯微鏡則更有助于定位。在暗視野背景下，金銀粒呈金黃色閃光顆粒，即使微董金銀也可定位。

11.鈾-鉛電鏡染色，電鏡觀察。

免疫金銀法敏感度高，金銀顆粒電子密度高，反差強；應用包埋前染色可先定位陽性反應部位再作電鏡超薄切片，獲得陽性反應概率高，特別適用于含微量抗原的部位，如突觸等。其不足是須經暗室顯影，手續(xù)較繁雜，包埋前免疫染色易增加非特異性染色。另外，由于單個金粒周圍結合的銀粒不是固定的，受多種因素影響。因此，電鏡免疫金粒染色法的金粒銀粒計算不適于做半定量觀察，誤差較大。

第五節(jié) 其它免疫電鏡技術

一、凝集素電鏡標記技術

凝集素的特性及標記原理詳見親和細胞化學凝集素節(jié)，近年來，凝集素電鏡標記技術應用日益廣泛，且獲得較為滿意的效果。凝集素電鏡標記技術方法較多，常用的有凝集素-酶（常用為HRP）、凝集素生物素-酶電鏡標記技術。現(xiàn)將凝集-酶電鏡標記技術（包埋前染色）簡介如下（Sterit和Kreatzberg，1987）。

1.固定：常用為PLP或多聚甲醛-戊二醛固定液。如為取腦組織，可將已灌注動物在4℃過夜，次日取腦組織置0.1mol/L磷酸或二甲眒酸鈉緩沖液（含7.5％蔗糖）中漂洗。

2.振動切片機（vibratome）切60微米的厚片。

3.切片孵育在PBS（內含0.1mol/LCaCl2、MgCl和MnC[i）10分鐘（有作者主張此步可省略）。

4.為增強細胞通透性，切片可孵育于含0.1％胰蛋白酶和0.1%。CaCl2水溶液中，pH7.8，37℃孵育30分鐘。

5.PBS洗3次，每次2min。

6.凝集素HPR 1:10在PBS中（內含0.1%Tritom X-100）4℃過夜，最好不斷輕輕振蕩。

7.PBS洗3次，每次2min。

8.DAB-H₂O₂顯色。

9.1%0sO₄水溶液固定。

10.系列酒精脫水，EPON包埋，切片。

11.電鏡鉛鈾雙染觀察。

凝集素呈高電子密度常沉積在細胞膜上，易與電子染色相區(qū)別。

二、掃描免疫電鏡技術

掃描免疫電鏡技術可為研究細胞或組織表面的三維結構與抗原組成的關系提供可能性。

（一）標記物

應用于掃描電鏡的標記物應能在掃描電鏡可分辨的范圍內，并能對細胞或組織抗原有較好的定位能力。在選擇標記物時應根據研究目的而定，如標記細胞等由于體積較大，可用體積大的標記物；如鑒別陽性（標記細胞）與陰性（未標記細胞），而要定位受體等則需選用較小的，易于辨認的標記物。

常用的標記物為顆粒性標記物。依其特性可分為：

1.蛋白類如血藍蛋白、鐵蛋白等。

2.病原體類如煙草花葉病毒、南方菜豆花葉病毒、噬菌體T4、大腸桿菌凸、噬菌體等。

3.金屬顆粒

膠體金、免疫金銀標記技術和同位素放射性自顯影的銀顆粒等。其中以金屬類顆粒標記物應用最為廣泛。最常用的是膠體金，膠體金商品提供的直徑從3-150納米左右不等。掃描免疫電鏡常用的金顆粒直徑在30-60納米左右為宜，由于金本身系重金屬，有較強的發(fā)射2次電子的作用，故不需噴鎖金屬膜，這是膠體金應用于免疫掃描電鏡的標記優(yōu)于其它標記物之處。免疫金銀染色能加強細胞或組織表面金屬顆粒聚集的密度。金、銀粒在電鏡顯示為電子密度高，外形清晰的顆粒易于識別和定位。病原體標記物主要利用其特殊的外形和結構以達到標記定位的目的，如噬菌體飛形似星形的球拍，頭部大小約100納米直徑，呈六角形星狀，尾長約100納米，由頸部與頭部相接；煙草葉病毒為15納米×30納米的桿狀病毒，而南方菜豆花葉病毒是直徑25納米的圓形顆粒，這些病原體的典型外形很易于辨認。鐵蛋白由于含有致密的鐵離子核心具有較高的電子密度，從而達到標記定位的目的。血藍蛋白是由海螺類軟件動物中提取的多分子聚合物，其外形為35納米X 50mn的柱狀體，多應用于病毒研究，但也有利用血藍蛋白與過氧化物等和糖蛋白部分可與凝集素相結合的特性，進行細胞膜受體的定位。

（二）免疫標記方法

金屬類標記物的免疫標記法同切片免疫染色，即將標記物與抗體相結合，通過直接或間接法顯示抗原部位。膠體金可與蛋白A相結合后與IgG分子中的Fe段相結合。如與卵白素（avidin）相結合可與結合抗體的生物素（biotin）反應。免疫金銀染色法在膠體金標記后，再進行銀液顯影。病毒（包括噬菌體）標記物多采用不標記抗體法，即搭橋法。此法的原理是采用同種動物制備抗原的特異性抗體與標記物抗體（例如兔抗A抗原與兔抗HRP）再用另一種動物制備第一種動物血清抗體的抗體（例如羊抗兔lgG抗體）。利用后者為橋，把抗原的特異性抗體與抗標記物抗體結合起來，后者再與標記物結合，以達到定位抗原的目的，其基本原理與PAP法類同。

病原體免疫標記可不用標記物顯示，而利用其形態(tài)學特征定位或采用抗原抗體凝集法，其基本原理是利用病毒或病毒抗原的特異性抗體在與相應的抗原反應后，使后者之間發(fā)生交聯(lián)而凝集，經濃縮后用陰性染色法（負染）便可在電鏡下顯示定位部位。

（三）掃描免疫電鏡的具體操作步驟

1.標本處理

（1）細胞懸液：用10毫升 PBS內含lmg/毫升牛血清白蛋白（PBS-BSA）懸浮細胞，離心250克，5分鐘×2。加入PBS-BSA至105~106細胞／ml，振搖成單細胞懸液。BSA能減低生物標本的非特異性吸附，但注意濃度應適宜，過高時會減弱特異性反應。

（2）細胞附著于固體支持物：由于固定與免疫標記的孵育過程會引起細胞凝集，妨礙細胞表面的暴露，而且反復的離心與懸浮會導致細胞表面形態(tài)的改變。因此，通常將懸液中的細胞粘附于過濾膜或涂有帶正電荷聚合物的蓋玻片上，在粘附之前可先清洗標本，以除去細胞表面的附著物。固體支持物可用涂有多聚-L-賴氨酸薄膜的載片或直徑13納米，孔徑0.22或0.45微米的過濾膜，載片制備方法：多聚L-賴氨酸（Sigma）100μg/毫升重蒸水溶解涂抹于載片上，4℃30分鐘后傾倒掉表面液體，令其自然干燥。注意載玻片事先需要清潔液浸泡，水漂洗過夜，然后浸泡于酒精或丙酮中，用前取出自然干燥或用綢巾拭干。將細胞懸液（如細胞數(shù)少可事先離心，取沉淀細胞），滴于濾膜或載片上，由于多聚賴氨酸的粘咐性，在固定及免疫標記過程中細胞不至于脫落。但注意勿使細胞干燥。

（3）組織切片與固體組織：組織切片如為石蠟包埋應預先脫蠟，由二甲苯經梯度酒精至水。組織切片與固體組織（勿過大）均應以PBS-BSA沖洗，并保持濕潤避免干燥。

2.固定

（1）固定前用PBS-BSA沖洗5分鐘×3。

（2）選擇加入適合的固定劑：可為4％多聚甲醛＋0.1%-0.5％戊二醛在pH7.4的磷酸緩沖液中。室溫固定10-60分鐘，或4℃ 30-120分鐘。

（3）PBS-BSA 5分鐘×3。

（4）除去殘留的自由醛基，選以下任一方法：

1）0.5毫克繃氫化鈉／1毫升 PBS 10分鐘（新鮮配制）

2）0.05-0.2mol/L甘氨酸或賴氨酸-HCI/PBS 30-60分鐘

3）0.1-0.Smol/L氯化鈉/PBS 30-60分鐘

4）p腮BSA沖洗5分鐘×3

3.免疫標記與透射免疫電鏡的原則及步驟基本相同。免疫金銀染色法舉例（張留保等，1987）

（1）血細胞以PBS-BSA洗5分鐘×3

（2）2％多聚甲醛-戊二醛混合液固定，4℃1小時

（3）PBS或TBS反復沖洗5分鐘×3

（4）膠體金免疫標記程序（略）

（5）暗室顯影液顯影

（6）掃描電鏡樣品制樣

（7）觀察

作者在血細胞膜外顯示了密集的金銀粒標記（特異性標記膜的谷胱甘膚過氧化物酶及激素膚）。

4.常規(guī)掃描電鏡標本處理

（1）PBS-BSA沖洗標本5分鐘×3。

（2）后固定：2.5%戊二醛0.1mol/L磷酸緩沖液，時間視樣本大小而定，一般室溫30分鐘左右。

（3）PBS-BSA洗5分鐘×3

（4）1%四氧化俄后固定1~2小時

（5）系列梯度酒精或丙酮脫水

（6）臨界點干燥或冰凍于燥'（7）噴鎖碳與金

（8）掃描電鏡觀察。

三、冷凍蝕刻免疫電鏡技術

冷凍蝕刻法（freeze etching），也稱冷凍復型法（freeze replica）或冷凍切斷（freeze fracture），是研究生物膜結構的重要方法之一。其主要步驟首先是將樣品在液氮中冷凍，然后放到真空噴鎖儀中切斷，切斷后的切面上有細胞器，其間還有凍成冰的水分。再加熱使冰升華，將水分蒸發(fā)，把細胞器的膜結構暴露出來，這一步驟就稱為冷凍蝕刻。如不進行蝕刻就稱為冷凍切斷。向暴露的膜結構上噴鎖鉛-碳投影，再噴碳來加固。這樣就在切斷的樣品表面形成一層復型膜。在此復型膜上印下了細胞切面的立體結構。從真空中取出樣品，把復型膜下面的組織腐蝕掉，再把復型膜撈在銅網上，在透射電鏡下觀察復型膜。

關于生物膜的分子結構，目前被大家公認的并為冷凍復型電鏡觀察所證實的是流動鑲嵌模型（圖18-1），即脂質-球狀蛋白質鑲嵌模型。依照這一模型學 ES說表明，生物膜是一種流動的、可塑的、鑲嵌蛋白質分子的脂質雙分子層的膜；脂質雙分子層中每一分子分別具有兩極，一端為親水極，朝向膜的內、外表面，而另一端的疏水極朝向膜的中線部位，兩排分子彼此相對，構成生物膜膜性結構的基礎。蛋白質分子彼此相對有嵌入性和表在性兩種，前者大約占蛋白質總械的3/4左右，外形近似球狀，PS細胞質面

圖18-1生物膜分子的流動鑲嵌模型及冷凍斷裂面圖解

鑲嵌在脂質分子層的不同深度內，而后者則大多附著于細胞膜的胞質面。在冷凍劈裂后，生物膜的水平斷面大多發(fā)生在單位膜的疏水極。因此，膜的親水部，分別命名為PS（與細胞質、核質或線粒體基質相鄰的面）和ES（與細胞外間隙或細胞內間隙相鄰的面，如內質網腔、核質間隙、線粒體內、外膜之間的腔和其它各種泡的腔等）。膜的疏水部、亦即劈裂面分別叫做EF（面向細胞質、核質或線粒體基質的面）和PF（向細胞外間隙或內間隙的面）。從70年代初期開始，冷凍蝕刻免疫電鏡技術已開始在應用，但由于免疫標記必須在冷凍蝕刻步驟以前進行，所以僅能標記細胞外表面（ES）。80年代開始建立了斷裂-標記細胞化學方法，將細胞膜劈開后，中央的兩側斷面（EF與 PF）以及各種細胞器膜的各個表面及細胞質與核質都能被標記，為此技術的廣泛應用創(chuàng)造了條件。應用此法還可對抗原與受體分子進行定量統(tǒng)計。

（一）冷凍蝕刻表面標記免疫電鏡技術

1.新鮮或固定的細胞進行直接法或間接法免疫標記。

2.PBS（pH7. 5）沖洗3分鐘×2，加lmmol/LMgCl₂蒸餾水洗3分鐘×3，離心沉集細胞。

3．將細胞團置于小紙板上，入液氮冷卻的Freon中，取出入冷凍蝕刻儀中進行斷裂操作，再于-100℃蝕刻l分鐘。

4.制作斷裂面復型。

5.用次氯酸鈉清洗復型，蒸餾水洗后進行觀察。

本法可顯示斷裂暴露的PF位于中央，周圍則是蝕刻后露出來的ES，標記物只出現(xiàn)在ES上。

（二）斷裂標記免疫電鏡技術

此法是先進行冷凍斷裂，再做免疫標記，從而可以對斷裂開的各種膜結構及胞漿斷面進行標記。

1.臨界點干燥法

（1）固定：1.0%-2.5％戊二醛PBS液4℃:1-2小時，PBS沖洗3分鐘×3。如為細胞懸液，可加入30%BSA后加入1％戊二醛，使BSA凝膠化，將凝膠切成2mm左右的小塊，用30％的甘油-PBS浸透后置于用液氮冷卻的Freon中冷卻。