摘要：近年來(lái) , 多肽藥物化學(xué)形成并迅速發(fā)展成為藥物化學(xué)的重要分支。而隨著分離純化技術(shù)的進(jìn)展 , 又大大加快了新活性多肽的發(fā)現(xiàn)和合成速度。在多肽合成中 , 許多雜質(zhì)顯示與產(chǎn)物類似的性質(zhì) , 隨著肽鏈的增長(zhǎng) , 分離的難度也增大 , 因此純化的方法和工藝顯得異常重要。本文綜述了凝膠過(guò)濾色譜、離子交換色譜和反相色譜等高效液相色譜技術(shù)在合成多肽分離與純化中的設(shè)計(jì)和應(yīng)用

關(guān)鍵詞： 高效液相色譜 合成 多肽 凝膠過(guò)濾色譜 離子交換色譜 反相高效液相色譜

多肽類藥物在臨床上顯示了巨大的應(yīng)用價(jià)值, 受到藥物化學(xué)家越來(lái)越多的重視, 多肽藥物的研究和開(kāi)發(fā)成為國(guó)際新藥技術(shù)領(lǐng)域競(jìng)爭(zhēng)中的重要方面。化學(xué)合成的肽產(chǎn)品是一個(gè)純度不好的粗產(chǎn)品, 其一是因?yàn)樵诤铣呻倪^(guò)程中各種副反應(yīng)、消旋化等造成的副反應(yīng)肽, 二是在脫保護(hù)過(guò)程中, 由于保護(hù)基的殘留, 肽鍵的斷裂、烷基化等造成的雜質(zhì)。雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與合成肽很相似, 或許二者之間僅僅在某一個(gè)位置的氨基酸殘基不同, 或許二者之間的差異僅僅在某一氨基酸殘基側(cè)鏈上某一基團(tuán)是否存在等等。由于雜質(zhì)與合成的肽在分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)上如此相似, 就給肽的分離純化帶來(lái)了困難 [1] 。因此, 根據(jù)對(duì)目的肽的要求, 需要選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行純化。

高效液相色譜 (HPLC) 是生物技術(shù)中分離純化的重要方法, 在多肽、蛋白質(zhì)的分離純化工藝中顯示出優(yōu)異的性能 [2] 。而且, 它已走出實(shí)驗(yàn)室投入到大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)中, 成為生物技術(shù)范圍內(nèi)一有力高效的分離工具 [3] 。目前用于分離純化合成多肽的HPLC模式主要有三種:一是凝膠過(guò)濾色譜, 按照肽分子的大小進(jìn)行分離, 二是離子交換色譜, 按肽分子所具有的帶電基團(tuán)的性質(zhì)和數(shù)目進(jìn)行分離;三是反相色譜, 按照肽分子的疏水性強(qiáng)弱進(jìn)行分離。

1 凝膠過(guò)濾色譜

凝膠色譜 (Gel Filtration Chromatography, GFC) 是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu), 根據(jù)多肽分子的大小、形狀差異進(jìn)行分離的一種方法。如人重組生長(zhǎng)激素 (hGH) 的分離, 不同結(jié)構(gòu)、構(gòu)型的GH在GFC柱上的分離行為完全不同, 從而可分離不同構(gòu)型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體。凝膠像分子篩一樣, 將大小不同、形狀各異的分子進(jìn)行分離, 因此凝膠色譜又叫分子篩層析或稱尺寸排阻色譜。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。

凝膠色譜具有很多優(yōu)點(diǎn):介質(zhì)為不帶電荷的惰性物質(zhì), 不與溶質(zhì)分子作用, 因此分離條件溫和, 產(chǎn)品收率高, 生物活性好;工作范圍廣, 分離分子量的覆蓋面大, 可分離從幾百至數(shù)萬(wàn)分子量的分子。Wang等 [4] 利用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定了玉米蛋白酶解產(chǎn)物寡肽的分子量分布;設(shè)備簡(jiǎn)單, 易于操作, 周期短, 每次分離之后不需再生故而可繼續(xù)使用, 有的連續(xù)使用幾百次甚至達(dá)千次。這些優(yōu)點(diǎn)使凝膠色譜已成為一種通用的分離方法, 在多肽合成制備技術(shù)中獲得廣泛應(yīng)用, 促腎上腺皮質(zhì)激素的多肽片段就是應(yīng)用Sephadex G-50分離制備的。凝膠過(guò)濾色譜在脫鹽操作及逐步接肽和片段縮合反應(yīng)的分離中尤其重要。Ljevakovic等 [5] 采用凝膠過(guò)濾色譜SephadexG-25和SP-Sephadex C-25離子交換色譜, 對(duì)合成的肽聚糖單體衍生物進(jìn)行了分離純化。Heller等 [6] 合成了具有生物學(xué)活性的鮭魚降鈣素類似物, 為便于受體篩選研究, 將多肽進(jìn)行放射性標(biāo)記, 標(biāo)記的多肽經(jīng)過(guò)GFC和反相HPLC的純化, 用于研究降鈣素多肽與受體的作用機(jī)制。

凝膠色譜的主要產(chǎn)品有Sephadex系、Sepharose系、Bio-Gel A系、Bio-Gel P系、Sephacryl系、Superdex系及Bio-Beads S-X系等。

2 離子交換色譜

離子交換色譜 (Ion Exchange Chromatography, IEC) 是通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換, 而達(dá)到分離目的的方法。該法主要依賴電荷間的相互作用, 利用帶電分子中電荷的微小差異進(jìn)行分離, 且有較高的分離容量。幾乎所有的生物大分子都是極性的, 都可使其帶電, 所以離子交換法已廣泛用于生物大分子的分離純化。由于離子交換色譜分辨率高、工作容量大且易于操作, 它已成為蛋白質(zhì)、多肽、核酸及大部分發(fā)酵產(chǎn)物分離純化的一種重要方法, 在合成多肽分離中約有75%的工藝采用離子交換色譜 [7] 。在α-黑素細(xì)胞增長(zhǎng)激素和促腎上腺皮質(zhì)激素多肽的合成中, 就是應(yīng)用羧甲基纖維素進(jìn)行分離的。王賢純 [7] 等利用IEC比較研究了固相化學(xué)合成的多肽類神經(jīng)毒素虎紋捕鳥(niǎo)蛛毒素-Ⅰ (HWTX-Ⅰ) 與其對(duì)應(yīng)的天然產(chǎn)物的色譜行為差異及分離純化方法。推測(cè)除了在合成HWTX-Ⅰ復(fù)性過(guò)程中有少數(shù)分子發(fā)生二硫鍵錯(cuò)配外, 還有部分分子在固相合成中發(fā)生了消旋作用, 需要交替采取多種色譜法才能完全分離純化復(fù)性后的合成多肽產(chǎn)物。

IEC可在中性條件下, 利用多肽的帶電性不同分離純化化學(xué)合成的多肽。要獲得優(yōu)良的分離結(jié)果, 必須選用適合的離子交換劑, 如離子交換劑的種類、交換功能基的強(qiáng)弱。離子交換柱可分為陽(yáng)離子柱與陰離子柱兩大類, 還有一些新型樹(shù)脂, 如大孔型樹(shù)脂、均孔型樹(shù)脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹(shù)脂等。在多肽類物質(zhì)的分離純化中, 還應(yīng)進(jìn)一步確定適用的pH值和洗脫條件, 尤其是洗脫劑的離子強(qiáng)度、鹽濃度等對(duì)純化影響較大。線性離子濃度梯度洗脫是最基本的洗脫方式, 通常多肽的濃度洗脫采用在磷酸鹽、Tris [8] 或檸檬酸緩沖液的流動(dòng)相中改變氯化鈉或氯化鉀的濃度以達(dá)到洗脫的目的。Huang等 [9] 報(bào)道, 利用離子交換色譜法, 探討純化合成胸腺素α1的條件, 獲得了有價(jià)值的數(shù)據(jù)供該物質(zhì)的放大生產(chǎn)。在制備性的純化中, 使用大容量的制備型離子交換柱也十分方便, 而且效率很高。

對(duì)多肽分子進(jìn)行分離純化可采用兩種方式, 一是將目的產(chǎn)物離子化, 被交換到介質(zhì)上, 雜質(zhì)不被吸附, 從柱流出, 稱為“正吸附”。此法優(yōu)點(diǎn)是目的產(chǎn)物純度高, 且可達(dá)到濃縮目的, 宜處理目的產(chǎn)物濃度低且工作液量大的溶液。另一方式是將雜質(zhì)離子化后被交換, 而目的產(chǎn)物不被交換直接流出, 這種方式稱為“負(fù)吸附”。采用此法通?？沙?0%~70%的雜質(zhì), 適用于目的產(chǎn)物濃度高的工作液。以上兩種方式的選擇要依據(jù)樣品及具體要求而定。無(wú)論是正吸附還是負(fù)吸附, 離子交換色譜均已成為多肽化學(xué)中一重要的分離方法。

3 反相高效液相色譜

反相高效液相色譜 (Reversed-phase High-performance Chromatography, RP-HPLC) 具有十分高的分辨力, 分離對(duì)象幾乎覆蓋了所有類型的化合物。由于可使用揮發(fā)性沖洗劑作為流動(dòng)相, 所以這種色譜不僅適用于分析型的實(shí)驗(yàn), 還適用于制備型的分離。反相色譜利用非極性的反相介質(zhì)為固定相, 極性有機(jī)溶劑 (如甲醇、乙腈等) 或其水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離 [10] , 是根據(jù)溶質(zhì)極性 (疏水性) 的差別進(jìn)行分離純化的洗脫色譜法。

RP-HPLC主要用于分子量低于5 000, 尤其是1 000以下的非極性小分子多肽的分析和純化 [11, 12] , 分離多采用降低流動(dòng)相極性 (水含量) 的線性梯度洗脫法 [13] 。李順子等 [14] 應(yīng)用反相高效制備液相色譜法, 對(duì)5種合成的蜂毒肽類似物進(jìn)行了分離制備。當(dāng)用極性較強(qiáng)的洗脫液做流動(dòng)相時(shí), 主峰的保留時(shí)間短, 且主峰和前后的雜質(zhì)峰不能很好的分開(kāi);隨著洗脫液極性減弱至某一值時(shí), 主峰和雜質(zhì)峰的保留時(shí)間均向后延長(zhǎng), 且時(shí)間間隔加大, 可以成功地對(duì)多肽樣品進(jìn)行分離制備。用多肽分子中各氨基酸保留常數(shù)加和值的方法可以預(yù)測(cè)不同多肽的保留時(shí)間, 為選擇分離純化多肽所需的流動(dòng)相提供了參考作用。經(jīng)半制備分離純化后的產(chǎn)物用分析型RP-HPLC測(cè)定達(dá)到了很高的純度, 氨基酸分析結(jié)果表明得到了所需的肽段, 可用于下一步的研究工作。

目前RP-HPLC分離柱仍然是以硅膠基質(zhì)的鍵合相填料為主體。尤其是鍵合C18 (Octadecyl silica, ODS) [15] 、C8烷基以及苯基填料的出現(xiàn), 使該技術(shù)得到長(zhǎng)足發(fā)展。這類填料的最大特點(diǎn)是顆粒剛性好, 有利于傳質(zhì), 可以得到很高的柱效, 并有良好的選擇性。硅膠基質(zhì)填料的pH值適應(yīng)性一般均限制在2~8。高分子基質(zhì)的RP-HPLC填料, 目前較為廣泛使用的是微球形交聯(lián)聚苯乙烯樹(shù)脂。這類樹(shù)脂的表面具有烷基鍵合相那種非極性的特征, 因此無(wú)須化學(xué)改性即可直接用作RP-HPLC的填料, 如TSK gel Octadecyl-4PW和TSK gel Octadecyl-NPR。

4 合成多肽分離與純化的設(shè)計(jì)與應(yīng)用策略

以上提到的分離多肽的技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中多相互結(jié)合, 根據(jù)合成多肽性質(zhì)的不同, 采用不同的分離純化手段。正確的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是選用最少的分離步驟達(dá)到最佳的分離效果。因?yàn)槊恳徊降姆蛛x過(guò)程中總有部分樣品不可避免地?fù)p失掉, 尤其是肽的濃度非常低時(shí), 應(yīng)盡量避免分離步驟過(guò)多。周賀鉞 [16] 等應(yīng)用固相方法合成了人甲狀旁腺素, 合成的多肽用三氟乙酸處理, 從Wang樹(shù)脂上切除。所得粗肽用SP-Sepharose-FF色譜柱和半制備型高效液相色譜進(jìn)行二步分離純化。分離結(jié)果經(jīng)鑒定純度在92%以上, 通過(guò)電噴霧質(zhì)譜法測(cè)定其分子量與計(jì)算值相符為4 116 D, 總收率為8%。另外, 高效液相色譜法如果與其它分離純化多肽的方法如電泳聯(lián)合使用, 將得到更好的分離效果。Sanz-Nebot [17] 等采用反相色譜-質(zhì)譜 (LC-MS) 聯(lián)用的方法與毛細(xì)管電泳 (CE) 聯(lián)合, 對(duì)合成的促性腺素釋放激素類似物leuprolide的粗品進(jìn)行分離和分析?；旌衔锵炔捎肔C-MS進(jìn)行分析和部分收集, 收集的組分隨后用CE進(jìn)一步分離純化, 兩種正交方法的聯(lián)用突出了各自的選擇性, 產(chǎn)品純度高。

5 結(jié)語(yǔ)

生物技術(shù)必須實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化才能取得應(yīng)有的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益, 根據(jù)國(guó)際發(fā)展生物技術(shù)的經(jīng)驗(yàn)和資料可知:在醫(yī)藥領(lǐng)域中, 下游技術(shù)在生物技術(shù)產(chǎn)品中所占比例極大, 我國(guó)發(fā)展藥物高新技術(shù)的實(shí)踐也證明如此。可以說(shuō), 下游技術(shù)是新藥高科技實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。制藥工程的下游技術(shù) (the downstream of biotechnology) 中, 產(chǎn)品的分離純化是其中最主要的組成部分。多肽產(chǎn)物在制藥工業(yè)和臨床治療中的應(yīng)用取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展, 因此, 建立一套完整的多肽分離純化技術(shù)具有重要意義。

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