eIF4G2：Eukaryotic Translation Initiation Factor 4 Gamma 2；真核起始因子（eIF)

uORF：upstream open reading frame，上游開(kāi)放閱讀框

UTR：untranslated region，非翻譯區(qū)

在本研究中，為探究去極化如何影響局部樹(shù)突生物學(xué)，采用樹(shù)突靶向的鄰近標(biāo)記方法（proximity labeling approach，PL），交聯(lián)免疫沉淀（crosslinking immunoprecipitation，CLIP），核糖體分析（ribosome profiling）和質(zhì)譜分析（mass spectrometry）。使用KCl或谷氨酸激動(dòng)劑DHPG讓初級(jí)皮質(zhì)神經(jīng)元去極化引起樹(shù)突蛋白表達(dá)的快速重編程。去極化增加uORF及其下游編碼序列的翻譯，使參與長(zhǎng)期增強(qiáng)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和能量代謝的蛋白質(zhì)局部生成成為可能。這種活動(dòng)依賴(lài)的翻譯伴隨著翻譯起始因子eIF4G2的磷酸化和募集，并且翻譯的uORF足以調(diào)控去極化誘導(dǎo)的eIF4G2依賴(lài)的翻譯。本研究揭示了eIF4G2將活動(dòng)依賴(lài)的uORF翻譯與局部樹(shù)突重塑相偶聯(lián)。

樹(shù)突TurboID識(shí)別突觸后RNA和蛋白質(zhì)

使用TurboID在目標(biāo)蛋白10-50 nm半徑內(nèi)特異性對(duì)鄰近蛋白質(zhì)進(jìn)行生物素化。通過(guò)將TurboID連接到編碼PSD95的轉(zhuǎn)錄本元件來(lái)實(shí)現(xiàn)樹(shù)突定位，PSD95是由多西環(huán)素誘導(dǎo)的慢病毒構(gòu)建體表達(dá)的（圖1a）。PSD95的UTRs是TurboID-PSD95樹(shù)突定位所必需的（圖S1b）。在靜息狀態(tài)下的神經(jīng)元中，外源性添加生物素可在30 min內(nèi)誘導(dǎo)劇烈的生物素化從而局部標(biāo)記鄰近蛋白（圖1b-c）。

樹(shù)突中活動(dòng)驅(qū)動(dòng)的RNA定位和翻譯對(duì)于調(diào)節(jié)突觸蛋白質(zhì)組和誘導(dǎo)神經(jīng)元回路的長(zhǎng)期修飾至關(guān)重要。然而，對(duì)神經(jīng)元激活后突觸后RNA調(diào)控的動(dòng)力學(xué)知之甚少。使用KCl（“dep”）或特定的谷氨酸激動(dòng)劑DHPG來(lái)急性去極化神經(jīng)元（圖1d-e）。通過(guò)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高來(lái)評(píng)估神經(jīng)元去極化，大多數(shù)（~80%）神經(jīng)元被激活（圖1f）。KCl和DHPG的去極化導(dǎo)致相似的生物素化、磷酸化、IEG表達(dá)和鈣內(nèi)流（圖1e、圖S1j-l）。

為分離去極化前后富集的局部樹(shù)突狀mRNA，整合TurboID proximity ligation（PL）和CLIP技術(shù)，并將該策略命名為PL-CLIP。使用鏈親和素（ streptavidin）純化表達(dá)TurboID的神經(jīng)元中biotin-labeled UV-crosslinked RNA-protein復(fù)合物，并純化直接與生物素化蛋白質(zhì)組結(jié)合的RNA。靜息狀態(tài)樹(shù)突的PL-CLIP數(shù)據(jù)與先前發(fā)表的neuropil轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)集吻合良好（圖2a），表明PL-CLIP可以高特異性地區(qū)分亞細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。

為探究樹(shù)突富集轉(zhuǎn)錄本編碼的作用，在靜息狀態(tài)樹(shù)突中進(jìn)行基因集富集分析(GSEA)。與突觸后膜、樹(shù)突發(fā)育和細(xì)胞骨架相關(guān)的基因集被富集（圖2b）。幾種已知定位于靜息狀態(tài)樹(shù)突的轉(zhuǎn)錄本被富集，包括Shank1、Rpl24、Map1b、Syn1、Tamm41、Uqcrc1（線(xiàn)粒體RNA）和Frmd6（圖2c）。這些數(shù)據(jù)表明PL-CLIP特異性富集樹(shù)突特異性RNA。

使用PL-CLIP來(lái)鑒定神經(jīng)元去極化后的樹(shù)突RNA。參與RNA加工、3′端RNA調(diào)控、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和RNP顆粒的編碼蛋白質(zhì)的RNA在去極化樹(shù)突中富集（圖2d）。P小體和RNP顆粒在突觸刺激下分解。接下來(lái)研究去極化后樹(shù)突RNA的分布。Shank1、Rpl24、Map1b、Syn1、Tamm41、Uqcrc1和Frmd6在去極化后表現(xiàn)出樹(shù)突富集的變化。Rpl24和Uqcrc1表現(xiàn)出去富集的現(xiàn)象，F(xiàn)rmd6更局限于樹(shù)突（圖2c）。FRMD6調(diào)控肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)，它在樹(shù)突中的優(yōu)先定位表明，細(xì)胞骨架過(guò)程在響應(yīng)神經(jīng)元激活時(shí)發(fā)生了改變。

活動(dòng)相關(guān)的較長(zhǎng)的3' UTR的存在可能反映了這些轉(zhuǎn)錄本快速募集到樹(shù)突的PSD95局部亞區(qū)，并允許突觸通過(guò)同種異構(gòu)體選擇性解碼基因組信息。這些3' UTR可能發(fā)揮多種作用，從調(diào)節(jié)局部翻譯到RBP的招募和產(chǎn)生替代蛋白質(zhì)編碼異構(gòu)體。

使用RNAscope熒光原位雜交（FISH）驗(yàn)證在靜息和激活的神經(jīng)元中PL-CLIP結(jié)果。為了解樹(shù)突定位RNA在多大程度上決定了局部蛋白質(zhì)含量，對(duì)靜息和KCl去極化神經(jīng)元的生物素化蛋白質(zhì)組進(jìn)行質(zhì)譜分析（MS）。由于TurboID是一種生物素連接酶，對(duì)每個(gè)樣本使用“負(fù)生物素”條件，其中表達(dá)等效的TurboID但不添加生物素，以減去標(biāo)記為無(wú)時(shí)間特異性的蛋白質(zhì)（圖2e）。

樹(shù)突TurboID識(shí)別突觸后翻譯體

去極化條件下PL-CLIP和PL-MS數(shù)據(jù)缺乏相關(guān)性，探究局部翻譯的快速變化是否可以在去極化后塑造局部蛋白質(zhì)組。神經(jīng)元轉(zhuǎn)導(dǎo)TurboID-PSD95導(dǎo)致樹(shù)突蛋白和核糖體的生物素化，如鏈霉親和素pulldown后的western blot所示（圖3a），以及免疫熒光中RPL10A與鏈霉親和素共定位（圖3b）。RPL10A是60S核糖體亞基的一個(gè)組成部分。為探究突觸后的樹(shù)突翻譯，將TurboID標(biāo)記與核糖體分析結(jié)合起來(lái)（對(duì)核糖體保護(hù)的mRNA片段進(jìn)行深度測(cè)序）。從表達(dá)Pan-TurboID和表達(dá)TurboID-PSD95的細(xì)胞中純化生物素化核糖體，并使用測(cè)序方法定量input和pulldown的核糖體保護(hù)的mRNA小片段（圖3a）。

為確定核糖體是否以亞區(qū)特異性的方式被標(biāo)記，分析了Pan-TurboID和TurboID-PSD95的input和pulldown中的核糖體保護(hù)片段。盡管Pan-TurboID提供了整個(gè)神經(jīng)元的信息，但TurboID-PSD95僅針對(duì)樹(shù)突狀核糖體（圖3c）。

在靜息樹(shù)突中，PL-Ribo-seq發(fā)現(xiàn)了在PL-CLIP中也發(fā)現(xiàn)的基因集，這些基因集在突觸后、谷氨酸能突觸、微管細(xì)胞骨架和內(nèi)體中發(fā)揮作用，并且在編碼核小體、DNA包裝、線(xiàn)粒體翻譯和翻譯調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的基因集中缺失（圖3d）。免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄本僅存在于靜息樹(shù)突中，它們?cè)陟o息樹(shù)突翻譯組中大量富集（圖3d），先前有證據(jù)表明MHC分子在突觸連接重塑中的重要性。

KCl-去極化樹(shù)突顯示具有不同功能的特定mRNA的翻譯改變。參與G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)傳導(dǎo)和突觸后化學(xué)傳遞的Sphk1、Rgs14和Ghrl。Apobec1和Igf2bp1，在調(diào)節(jié)3' UTR的結(jié)合中起作用。Pml和Eif1ad3，與翻譯起始相關(guān)。參與ATP偶聯(lián)呼吸和線(xiàn)粒體蛋白輸入的P2rx7和Timm23在去極化反應(yīng)中顯示樹(shù)突翻譯增加（圖3e）。這些mRNA存在于去極化樹(shù)突翻譯體中大量存在的基因集中（圖3f）。

為進(jìn)一步了解活動(dòng)依賴(lài)的局部翻譯控制，分析了去極化后翻譯的整體變化。在神經(jīng)元去極化過(guò)程中，翻譯下調(diào)可能允許能量和資源的恢復(fù)和/或恢復(fù)到再極化狀態(tài)。核糖體復(fù)合體在去極化后發(fā)生了劇烈的重排。局部翻譯比RNA的存在更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)了局部蛋白質(zhì)組的組成，特別是在對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的反應(yīng)中。

樹(shù)突狀uORF調(diào)節(jié)下游CDS的翻譯開(kāi)關(guān)

在神經(jīng)元去極化過(guò)程中，整體翻譯減少，但并沒(méi)有說(shuō)明特定轉(zhuǎn)錄物是否以及如何被翻譯上調(diào)以滿(mǎn)足突觸的需要。在去極化時(shí)，樹(shù)突定位mRNA的5' UTR中的核糖體占用增加（圖3g）。這是特異于樹(shù)突亞區(qū)的，因?yàn)榭偟暮颂求w庫(kù)的核糖體分析沒(méi)有揭示5' UTR核糖體占用的任何整體變化（圖3g）。

為更好地理解5' UTR中核糖體占用率的增加如何影響翻譯，使用ORF-RATER（一種基于核糖體分析數(shù)據(jù)特征識(shí)別翻譯OFR的算法）識(shí)別初級(jí)皮質(zhì)神經(jīng)元5' UTR中翻譯的uORF。將翻譯的uORF集合與PL-Ribo-seq結(jié)合，發(fā)現(xiàn)KCl和DHPG去極化激活神經(jīng)元，導(dǎo)致樹(shù)突中uORF的翻譯整體增加（圖3h），盡管它們對(duì)應(yīng)的CDS的翻譯在各個(gè)mRNA之間是不同的。例如，Gria2 5' UTR中存在的uORF的翻譯隨著去極化而增加，但這并不伴隨著下游CDS表達(dá)的實(shí)質(zhì)性變化（圖3i）。Homer3和Atf3在去極化時(shí)顯示出uORF翻譯的增加，同時(shí)樹(shù)突中CDS翻譯的增加（圖3i）。Apaf1的5' UTR和CDS翻譯都因去極化而減少。Mphosph9在5' UTR中翻譯增加，而在CDS中翻譯減少（圖3i）。對(duì)于大多數(shù)在去極化后其5' UTR中核糖體占用率增加的樹(shù)突狀mRNA, CDS翻譯量相應(yīng)增加，而轉(zhuǎn)錄物水平?jīng)]有顯著變化。這些mRNA編碼的蛋白質(zhì)參與線(xiàn)粒體生物學(xué)、長(zhǎng)期增強(qiáng)和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)（圖3j）。一組具有增加5' UTR核糖體占用的轉(zhuǎn)錄本減少了CDS翻譯，但mRNA水平?jīng)]有顯著降低。這些編碼蛋白在免疫系統(tǒng)、微管過(guò)程和激酶結(jié)合中發(fā)揮作用，表明樹(shù)突狀mRNA的功能獨(dú)特群具有特異性但差異性的調(diào)節(jié)（圖3j）。去極化導(dǎo)致樹(shù)突狀uORF中核糖體占用率上調(diào)，從而導(dǎo)致下游CDS翻譯的復(fù)雜調(diào)控。

在不同的細(xì)胞類(lèi)型中，uORF可以阻礙或促進(jìn)下游CDS的翻譯，特別是處于應(yīng)激狀態(tài)。使用zipcodes來(lái)幫助報(bào)告mRNA的定位，從而探索神經(jīng)元活動(dòng)對(duì)樹(shù)突翻譯的影響。研究3個(gè)zipcodes，Camk2a-3′ UTR, BC1 and myristoylated-LDLR-C-terminal (myr-LDLRct) sequences，在皮質(zhì)神經(jīng)元中編碼flag標(biāo)記GFP70的報(bào)告mRNA的定位和樹(shù)突蛋白積累。通過(guò)FISH分析報(bào)告mRNA的定位，通過(guò)IF和turboid - psd95介導(dǎo)的生物素化分析了蛋白質(zhì)定位和樹(shù)突翻譯。發(fā)現(xiàn)myr-LDLRct最準(zhǔn)確地將大多數(shù)報(bào)告蛋白mRNA和蛋白定位到樹(shù)突上，并允許報(bào)告蛋白被TurboID-PSD95生物素化（圖4a-b），使能夠研究uORF和5' UTR的其他特征對(duì)活動(dòng)依賴(lài)性突觸后CDS翻譯的影響。

在皮質(zhì)神經(jīng)元中使用該報(bào)告基因，測(cè)試了Kcnj9-5' UTR，其中包含ORF-RATER識(shí)別的uORF，并通過(guò)PL-Ribo-seq顯示樹(shù)突中去極化后5' UTR和CDS翻譯增加（圖4c）。檢測(cè)到去極化后報(bào)告蛋白水平增加了2.5倍（圖4d）。這種效應(yīng)嚴(yán)格依賴(lài)于樹(shù)突定位和報(bào)告基因mRNA的5' UTR（圖4d），表明5' UTR與uORF足以賦予活動(dòng)依賴(lài)的翻譯控制。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)選擇了17個(gè)具有uORF的5' UTR來(lái)擴(kuò)展報(bào)告基因集：(1)它們?cè)谌O化過(guò)程中增加了樹(shù)突內(nèi)核糖體的占用；(2)它們與增加（圖4e）或減少（圖4f）樹(shù)突CDS翻譯水平的最大影響相一致，而它們的轉(zhuǎn)錄物水平?jīng)]有顯著變化；(3)除Polg和immp1外，它們大多未被研究。17個(gè)5' UTRs中有16個(gè)的下游效應(yīng)與來(lái)自?xún)?nèi)源基因的PL-Ribo-seq結(jié)果一致。通過(guò)DHPG激活三個(gè)5' UTR報(bào)告結(jié)構(gòu)(Cmc4, Lrrc51和Nsun3)進(jìn)一步證實(shí)了翻譯的活動(dòng)依賴(lài)性增加。相比之下，相同長(zhǎng)度的5' UTRs的打亂版本未能調(diào)節(jié)翻譯，這表明這些5' UTRs中的特定基序決定了下游CDS的翻譯調(diào)節(jié)（圖4e-f）。

為測(cè)試用GFP報(bào)告基因觀察到的翻譯對(duì)照是否準(zhǔn)確地再現(xiàn)了內(nèi)源性基因的控制，通過(guò)用Mphosph9或Kcnj9 CDS替換GFP（帶或不帶其5' UTR）來(lái)檢測(cè)自然環(huán)境下的mRNA。Mphosph9和Kcnj9是含有uORF的mRNA的例子，在去極化后樹(shù)突中5' UTR翻譯增加。通過(guò)PL-Ribo-seq, Mphosph9 CDS在翻譯中下調(diào)（圖3i），而Kcnj9則上調(diào)（圖4c）。使用樹(shù)突報(bào)告細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Mphosph9的翻譯減少，Kcnj9的翻譯增加，僅在它們的5' UTR存在的情況下，在這兩種情況下，在每種情況下都獨(dú)立于它們的mRNA水平（圖4-h）。

通過(guò)IF可視化這些蛋白質(zhì)在去極化后樹(shù)突中內(nèi)源性水平的變化（圖4i-j），突出了研究結(jié)果的穩(wěn)健性。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證帶uORF的5' UTR是神經(jīng)元去極化后驅(qū)動(dòng)樹(shù)突CDS翻譯變化的必要和獨(dú)立單元。

eIF4G2結(jié)合5'UTRs并調(diào)節(jié)局部mRNA翻譯

從機(jī)制上剖析uORF如何以活動(dòng)依賴(lài)和定位依賴(lài)的方式調(diào)節(jié)CDS翻譯。假設(shè)RBP可能介導(dǎo)uORF對(duì)下游翻譯的影響。使用RBPmap檢測(cè)樹(shù)突翻譯信息的5' UTR中富集的RBP結(jié)合位點(diǎn)。比較通過(guò)PL-Ribo-seq發(fā)現(xiàn)的所有樹(shù)突翻譯mRNA的5' UTR中的靜息、KCl-去極化和差異(去極化負(fù)靜息)核糖體占用，發(fā)現(xiàn)IGF2BP1、HNRNPK/L、eIF2α和eIF4G2的結(jié)合位點(diǎn)在所有去極化后被翻譯調(diào)節(jié)的mRNA的5' UTR中都富集(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7a)。

根據(jù)其下游CDS翻譯特性(CDS-up與CDS-down)進(jìn)一步劃分了具有5 ' UTR翻譯增強(qiáng)的樹(shù)突狀mRNA組，以評(píng)估特異性rbp是否與差異效應(yīng)相關(guān)。HNRNPK和TIA1結(jié)合位點(diǎn)在CDS-down組的5 ' UTRs中富集（圖5a），這與它們通過(guò)在5 ' utrs上結(jié)合而在翻譯抑制中的已知作用一致。相比之下，eIF4G2和RBFOX2結(jié)合位點(diǎn)僅在樹(shù)突中cdup組的5 ' utr中富集(圖5a)。

在eIF4G2的四個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)合基序中，' CGCGGC ' (eIF4G2(4))是翻譯上調(diào)的樹(shù)突狀mRNA的5 ' utr中最富集的基序（圖5a）。雖然翻譯的uORF的存在通常會(huì)導(dǎo)致下游CDS的翻譯減少，但也有一些例子表明它們也會(huì)增強(qiáng)下游CDS的翻譯。已知非規(guī)范翻譯起始因子eIF4G2在帽依賴(lài)性和帽非依賴(lài)性翻譯中發(fā)揮作用，并在非神經(jīng)元系統(tǒng)中上調(diào)具有結(jié)構(gòu)5' UTR或uORF的RNA的翻譯。先前已知eIF4G2在翻譯起始中的作用使重點(diǎn)放在eIF4G2作為樹(shù)突中潛在的活性依賴(lài)的翻譯調(diào)節(jié)因子上。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了神經(jīng)元活動(dòng)如何影響eIF4G2結(jié)合，通過(guò)在靜息和KCl去極化的初級(jí)皮質(zhì)神經(jīng)元中執(zhí)行eIF4G2 CLIP。' CGCGGC '基序是eIF4G2-CLIP中交聯(lián)最多的基序，與對(duì)樹(shù)突中發(fā)生翻譯控制的轉(zhuǎn)錄本的分析一致（圖5a）?？偟膩?lái)說(shuō)，大約50%的eIF4G2 CLIP結(jié)合定位在5' UTR中（圖S7e），這與它在翻譯起始中的作用一致?？傊?，這些數(shù)據(jù)暗示eIF4G2結(jié)合在去極化后的翻譯控制中。

利用CLIP數(shù)據(jù)，確定一組在其5' UTR中增加eIF4G2結(jié)合的mRNA，以響應(yīng)去極化。通過(guò)GSEA, eIF4G2結(jié)合的靶標(biāo)在線(xiàn)粒體相關(guān)mRNA中特別富集，此外還有編碼信號(hào)、受體聚類(lèi)和mRNA加工相關(guān)信息的靶標(biāo)（圖5b）。然后，使用PL-Ribo-seq和PL-CLIP數(shù)據(jù)集驗(yàn)證這組mRNA的樹(shù)突翻譯和定位。在去極化樹(shù)突中，在其5' UTR中有更多eIF4G2結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本在翻譯上上調(diào)，盡管它們的轉(zhuǎn)錄本水平降低（圖5c）。此外，與樹(shù)突中所有5' UTR翻譯增強(qiáng)的mRNA相比，去極化后5' UTR翻譯增加的eIF4G2結(jié)合靶標(biāo)顯示出更高的CDS翻譯水平（圖S7g)。總的來(lái)說(shuō)，這些分析表明，eIF4G2在5' UTR上的結(jié)合與樹(shù)突神經(jīng)元活動(dòng)響應(yīng)中獨(dú)立于mRNA水平的翻譯增強(qiáng)相關(guān)。

接下來(lái)，研究Nsun3的調(diào)控，因?yàn)樗霓D(zhuǎn)錄物中含有一個(gè)活動(dòng)依賴(lài)的uORF，對(duì)下游CDS翻譯的影響最大（圖4e），其5' UTR中存在eIF4G2結(jié)合位點(diǎn)。Nsun3在線(xiàn)粒體翻譯中發(fā)揮作用，這與觀察一致，線(xiàn)粒體調(diào)控是去極化后最富集的樹(shù)突mRNA類(lèi)別（圖3j、圖5b）。通過(guò)PL-Ribo-seq，盡管局部轉(zhuǎn)錄本水平降低，但去極化樹(shù)突中Nsun3 CDS翻譯的絕對(duì)水平增加（圖8a）。Nsun3-5' UTR具有兩個(gè)內(nèi)源性eIF4G2結(jié)合位點(diǎn)，據(jù)此生成了具有多種突變的報(bào)告基因，以研究是否需要uORF翻譯和/或eIF4G2結(jié)合來(lái)增強(qiáng)CDS翻譯（圖5d）。野生型Nsun3 uORF和具有兩個(gè)額外eIF4G2結(jié)合位點(diǎn)（eIF4G2++）的Nsun3 uORF表現(xiàn)相似，在不影響mRNA水平的情況下，將下游GFP翻譯量提高了約3.3倍（圖5d）。盡管mRNA水平增加，但阻止uORF翻譯的突變體減少了翻譯量的增加。此外，消除所有eIF4G2結(jié)合位點(diǎn)（eIF4G2?）完全消除了CDS翻譯的去極化依賴(lài)性上調(diào)，這表明uORF翻譯和eIF4G2結(jié)合對(duì)于下游CDS上調(diào)都是必要的。

使用鄰近連結(jié)實(shí)驗(yàn)（proximity ligation assay，PLA），結(jié)合嘌呤霉素觀察翻譯和IF觀察總蛋白水平，能夠確認(rèn)內(nèi)源性Nsun3在靜息和去極化神經(jīng)元中的調(diào)節(jié)。與PL-Ribo-seq一致，隨著總蛋白水平的增加，去極化樹(shù)突中新翻譯的Nsun3顯著增加（圖S8c-d）。值得注意的是，這種活動(dòng)依賴(lài)性的翻譯增加依賴(lài)于eIF4G2，因?yàn)閟iRNA介導(dǎo)的eIF4G2敲低或其結(jié)合位點(diǎn)（eIF4G2?）的突變抑制了翻譯上調(diào)（圖5e）。

只有與Nsun3相似的具有eIF4G2結(jié)合位點(diǎn)的uORF依賴(lài)eIF4G2上調(diào)其CDS（例如Mtf1；圖S9j-k）。翻譯上調(diào)的eIF4G2結(jié)合的樹(shù)突狀mRNA和含有uORF的樹(shù)突狀mRNA在eIF4G2敲低后，顯示出活動(dòng)依賴(lài)的局部翻譯水平顯著下降（圖5f）。樹(shù)突5' UTR內(nèi)的eIF4G2結(jié)合對(duì)于uORF翻譯主開(kāi)放閱讀框的活動(dòng)依賴(lài)性增加是必要的。

為評(píng)估eIF4G2如何介導(dǎo)其活動(dòng)依賴(lài)的翻譯控制，測(cè)量了靜息和KCl去極化樹(shù)突中的eIF4G2總蛋白。雖然總eIF4G2略有增加，但并不顯著（圖S10b）。因此，假設(shè)eIF4G2磷酸化可能對(duì)其活動(dòng)依賴(lài)性作用至關(guān)重要（另一種eIF4G蛋白eIF4G3已被證明是鈣依賴(lài)性磷酸化的靶標(biāo)），發(fā)現(xiàn)鈣在去極化時(shí)內(nèi)流（圖1e）對(duì)觀察到的翻譯變化至關(guān)重要（圖S10c）。為此，利用樹(shù)突定位信號(hào)（圖4a、5f）設(shè)計(jì)樹(shù)突定位的野生型和磷酸化突變型eIF4G2，并通過(guò)這些eIF4G2在整個(gè)神經(jīng)元中被耗盡的變體恢復(fù)了eIF4G2水平。所有eIF4G2突變體的積累水平與野生型蛋白相似，只有T507V突變體完全未能挽救活動(dòng)依賴(lài)的翻譯控制，表明該位點(diǎn)可能對(duì)鈣介導(dǎo)的eIF4G2合成樹(shù)突狀蛋白的調(diào)控至關(guān)重要。

參考資料：

[1] Hacisuleyman, E., Hale, C.R., Noble, N. et al. Neuronal activity rapidly reprograms dendritic translation via eIF4G2:uORF binding. Nat Neurosci. (2024).