客戶：龍寶，我想要做熒光共定位，檢測(cè)兩個(gè)指標(biāo)的表達(dá)和相互作用情況，該怎么選擇抗體呢？有什么要注意的呢？

龍寶：

首先我們來回顧下，什么是免疫熒光和熒光共定位？

1. 免疫熒光：

是一種常用的細(xì)胞和組織學(xué)研究方法，用于觀察特定蛋白或分子在生物樣本中的位置和表達(dá)水平。其基本原理是利用免疫學(xué)原理，即利用專門設(shè)計(jì)的抗體與目標(biāo)蛋白或分子結(jié)合，然后通過熒光染料標(biāo)記的二抗來可視化這些特定蛋白質(zhì)。通過熒光顯微鏡觀察，可以立即看到目標(biāo)蛋白在樣本中的位置和表達(dá)水平。

2. 熒光共定位：

有時(shí)候需要觀察多個(gè)蛋白或分子在樣本中的位置關(guān)系，這時(shí)就需要進(jìn)行熒光共定位。在這種情況下，不同目標(biāo)蛋白會(huì)分別使用標(biāo)記了不同顏色熒光染料的二抗，然后通過熒光顯微鏡觀察。例如，如果需要觀察蛋白A和蛋白B之間的相互作用或共定位關(guān)系，可以使用標(biāo)記紅色和綠色熒光染料的二抗來標(biāo)記這兩種蛋白，然后在顯微鏡下觀察它們的位置關(guān)系。

通過免疫熒光和熒光共定位技術(shù)，研究人員可以在細(xì)胞和組織水平上詳細(xì)研究蛋白之間的相互作用、功能以及位置關(guān)系，從而幫助更深入地理解生物學(xué)過程。

確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方法：直接法or間接法？

· 間接法：如上述原理中提到的，使用不帶熒光標(biāo)記的一抗與抗原結(jié)合，再通過兩種帶有不同熒光的二抗與一抗結(jié)合的方法就是間接法。雖然操作步驟稍多，但信號(hào)放大效果好，二抗選擇范圍廣，性價(jià)比高。

· 直接法：利用兩種帶有不同熒光的直標(biāo)一抗與抗原結(jié)合。這種方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、特異性高、背景低。但信號(hào)放大效果有限，直標(biāo)抗體的選擇范圍較窄，價(jià)格較高。

選擇合適的抗體

注意事項(xiàng)1：如果選用間接法，需要確保所選的兩種熒光抗體互不干擾，避免交叉反應(yīng)等。直接法不需加二抗，則不需考慮此項(xiàng)。

注意事項(xiàng)2：選擇合適的熒光通道，避免熒光串色至關(guān)重要。熒光探針應(yīng)該選擇發(fā)射光譜分離比較大的且具有最小疊加的組合，通常選擇綠色和紅色作為主要通道，疊加區(qū)域顯示黃色，而且人眼對(duì)綠色和紅色色調(diào)更為敏感。此外，藍(lán)色和綠色可形成青色，藍(lán)色和紅色可形成紫色。但考慮到人眼對(duì)藍(lán)光的靈敏度較低，且DAPI常被用作細(xì)胞核的藍(lán)色熒光標(biāo)記，藍(lán)色通道不常用作主要通道。選擇合適的熒光染料還需考慮設(shè)備的配置，及目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況，熒光染料高度有強(qiáng)弱之分，抗原表達(dá)有高低區(qū)別，因此，對(duì)于一些低表達(dá)的抗原，我們?cè)诖钆鋵?duì)應(yīng)抗體的染料時(shí)，應(yīng)該選擇熒光較亮的染料。

 示例：

· 直接法：直接選擇帶有不同熒光基團(tuán)的抗體，如FITC-A抗體和PE-B抗體。

· 間接法：選擇不同種屬來源的一抗，如鼠抗A抗體和兔抗B抗體，再根據(jù)一抗種屬選擇對(duì)應(yīng)的熒光二抗，如AbBox Fluor 488-山羊抗小鼠二抗和AbBox Fluor 594-山羊抗兔二抗。確保一抗和二抗之間的特異性結(jié)合，避免交叉反應(yīng)。

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附錄：細(xì)胞免疫熒光操作步驟（供參考，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整）

1、爬片：消化細(xì)胞于玻底培養(yǎng)皿，保證玻片上的細(xì)胞以單細(xì)胞層生長(zhǎng)，細(xì)胞密度以達(dá)到75%-85%最佳。

2、固定：吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS清洗2-3遍。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入4%多聚甲醛，室溫靜置15分鐘，結(jié)束后用PBS清洗2-3遍。

3、透化：每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1 mL 0.1%皂苷（或Triton X-100 等，溶于PBST中）透化細(xì)胞10-20分鐘，結(jié)束后用PBS清洗2-3遍。注：如果是檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)蛋白或者細(xì)胞膜蛋白的胞內(nèi)段需要做此步驟。

4、封閉：每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1 mL 1%-3% BSA（或同物種血清溶于PBST中）室溫封閉30分鐘，結(jié)束后除去BSA。

5、一抗孵育：在培養(yǎng)皿中滴入用1%-3% BSA（溶于PBST中）稀釋好的一抗，4 ℃過夜孵育。一抗孵育結(jié)束后，1 mL PBS清洗2-3遍。

6、二抗孵育：按照實(shí)驗(yàn)需求，加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗（用1%-3% BSA的PBST稀釋），室溫避光孵育2小時(shí)，孵育結(jié)束后用PBS清洗2-3遍，每次5分鐘，此過程以及余下的操作應(yīng)全程避光。

7、DAPI染細(xì)胞核：在清洗完畢的細(xì)胞中滴加DAPI，室溫避光靜置約30秒，之后用PBS清洗2-3遍，每次5分鐘。

8、封片：在細(xì)胞上滴加一滴抗熒光猝滅劑，晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使其均勻覆蓋在細(xì)胞表面，蓋上蓋子。激光共聚焦系統(tǒng)記錄結(jié)果。

希望以上內(nèi)容能夠幫助您更好地理解和應(yīng)用免疫熒光共定位技術(shù)。