近年來貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)在農(nóng)業(yè)病蟲害防控方面受到廣大學(xué)者的關(guān)注，但部分研究主要以不同菌株資源的分離鑒定以及抑菌活性分析為目的，缺乏對(duì)菌株系統(tǒng)的研究，總體呈現(xiàn)優(yōu)良的菌株資源匱乏，且菌株的發(fā)展前景受功能單一、活性較低以及定殖能力偏弱等條件的限制^[1]。此外，微生物制劑對(duì)病害的防治效果受活菌數(shù)和抑菌活性物質(zhì)含量的影響，而各異的生理特性和生境條件偏好性往往決定菌株的最適生長(zhǎng)條件不同^[2-3]。因此，靶向已有高活性菌株，多方位挖掘其生物活性，并探究其最適生長(zhǎng)條件，不僅可為植物病害的生物防控提供優(yōu)良的菌株資源，而且可促進(jìn)菌株的規(guī)?；蜕虡I(yè)化應(yīng)用。    

貝萊斯芽孢桿菌是革蘭氏陽(yáng)性好氧細(xì)菌，菌體呈桿狀，能形成芽孢，廣泛分布于自然界的水體、土壤、空氣、植物根系、植株表面和動(dòng)物腸道等^[4]。近年來，國(guó)內(nèi)外有關(guān)貝萊斯芽孢桿菌的報(bào)道越來越多，研究主要集中在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、拮抗病原菌、誘導(dǎo)植物強(qiáng)化細(xì)胞壁、積累防御酶和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等防御反應(yīng)等方面^[5]。研究表明，貝萊斯芽孢桿菌對(duì)番茄早疫病原菌(Alternaria solani)和馬鈴薯瘡痂病原菌(Streptomyces galilaeus)具有良好的拮抗活性^[6]。菌株JS25R可產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)(如禾烷酮、2-壬酮和2-壬醇等)抑制谷鐮刀菌的菌體生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，從而降低小麥赤霉病的發(fā)病率^[7]。菌株YB15可通過分泌β-葡聚糖酶等抑菌活性物質(zhì)，從而對(duì)病原真菌起到拮抗作用^[8]。綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌在防治植物病害方面具有極大的潛力，但部分菌株功能單一，同時(shí)也缺乏對(duì)菌株多樣化的功能的進(jìn)行開發(fā)利用。此外，菌株的抑菌活性通常與菌株生物量、活性物質(zhì)產(chǎn)量以及菌株定殖能力的強(qiáng)弱相關(guān)^[9]。發(fā)酵條件優(yōu)化旨在營(yíng)造一個(gè)菌株生長(zhǎng)的適宜環(huán)境，促進(jìn)菌株生長(zhǎng)，提高菌株發(fā)酵液抑菌活性物質(zhì)的含量，從而提高菌株的防治效果^[10]。不同菌株具有不同的生理特性和生境條件偏好性，最適發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速以及碳源、氮源和無機(jī)鹽均有差異，如解淀粉芽孢桿菌L009在溫度28 ℃時(shí)，發(fā)酵72 h發(fā)酵液含菌量最大^[11]。解淀粉芽孢桿菌GM-1-2的最適發(fā)酵溫度為28 ℃，且發(fā)酵時(shí)間僅為30 h^[12]。暹羅芽孢桿菌的最適碳源為乳糖，最適氮源為酵母提取物^{[13]，而貝萊斯芽孢桿菌HC-01的最適碳}源為麥芽糖，最適氮源為蛋白胨^[14]。因此，針對(duì)不同菌株探索其適宜發(fā)酵條件，是將功能菌株應(yīng)用到生產(chǎn)、充分發(fā)揮其生防功能的關(guān)鍵步驟。    

優(yōu)良的菌種資源匱乏是制約植物病害生物防控的發(fā)展限制性因素之一，加強(qiáng)優(yōu)良菌株的篩選和改良及以現(xiàn)有菌株為靶標(biāo)，深入挖掘和評(píng)價(jià)菌株多樣化的生物活性，優(yōu)化其生產(chǎn)工藝是打破該壁壘的有效措施^[4]。本研究以現(xiàn)有高活性貝萊斯芽孢桿菌SH-1471為研究對(duì)象，該菌分離自健康煙草根際土壤，本身具有極強(qiáng)的定殖能力，基于PCR技術(shù)檢測(cè)菌株抗生素合成基因類別，并利用平板對(duì)峙法以及底物降解法等活性篩選模型，挖掘菌株對(duì)病原微生物的生防活性，溶磷、解鉀和固氮等促生長(zhǎng)活性以及產(chǎn)鐵載體、蛋白酶和纖維素酶等活性，并進(jìn)一步對(duì)其最適發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為農(nóng)用微生物制劑的發(fā)展提供高效且功能多樣化的菌株資源，且為該菌株的開發(fā)以及推廣利用奠定基礎(chǔ)。

功能菌株SH-1471由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所于健康煙草根際土壤分離與保存，并于2022年6月20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏編號(hào)：CCTCC No. M 2022923)。

文中涉及的指示病原物番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、煙草赤星病菌(Alternariaalternate)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、草果莖點(diǎn)霉屬葉斑病菌(Phoma matteuciicola)、草果枝枯病菌(Diaporthe eres)、煙草炭疽病菌(Colletotrichum micotianae)、煙草黑脛病菌(Phytophthora parasitica)和油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所分離、鑒定與保存。    

功能篩選培養(yǎng)基：解無機(jī)磷選擇培養(yǎng)基，解鉀選擇培養(yǎng)基，固氮選擇培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar, NA)培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutrient broth, NB)培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(potato dextrosebroth, PDB)，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextroseagar, PDA)培養(yǎng)基，脫脂牛奶培養(yǎng)基，纖維素培養(yǎng)基，果膠培養(yǎng)基，鉻天青(chrome azurol sulphonate, CAS)瓊脂雙層培養(yǎng)基^[15]。

優(yōu)化初始培養(yǎng)基：培養(yǎng)基A (g/L)：葡萄糖5.00，魚粉10.00，氯化鈉5.00、酵母膏5.00。酵母蛋白胨蔗糖培養(yǎng)基(yeast sucrose peptone medium, YSP) (g/L)：蛋白胨10.00，酵母浸粉5.00，蔗糖20.00。培養(yǎng)基D (g/L)：玉米淀粉3.00，硫酸銨10.00，磷酸二氫鉀15.00，蔗糖10.00。牛肉膏酵母葡萄糖培養(yǎng)基(nutrient yeast beef paste dextrose medium, NYBD) (g/L)：牛肉膏8.00，酵母浸粉5.00，葡萄糖10.00。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA) (g/L)：牛肉膏3.00，蛋白胨10.00，氯化鈉5.00。細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(LB) (g/L)：蛋白胨10.00，酵母浸粉5.00，氯化鈉10.00。121 ℃滅菌30 min。

抗生素合成基因PCR檢測(cè)，參照濮永瑜等^[16]的試驗(yàn)方法進(jìn)行。抑菌廣譜性測(cè)定：(1) 平板對(duì)峙試驗(yàn)：以上述10種病原真菌為指示病原物，在PDA培養(yǎng)基中心接種5 mm的病原菌菌餅，十字交叉在距離其25 mm處接種菌株，3個(gè)重復(fù)。(2) 發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)：將菌株SH-1471接種于NB培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，4 ℃、8 000 r/min冷凍離心5 min，使用0.22 μL無菌濾膜濾除菌體，得無菌發(fā)酵液，將其與PDA以1:4的比例混合均勻，制成帶毒平板后取5 mm的病原菌菌餅接種于平板中央，3個(gè)重復(fù)。以未接菌株SH-1471為對(duì)照，置于25?28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱黑暗條件培養(yǎng)5–7 d，記錄并計(jì)算抑制率。    

抑制率(%)=[對(duì)照組菌落直徑(cm)?處理組菌落直徑(cm)/對(duì)照組菌落直徑(cm)?0.5]×100。

功能測(cè)定：將菌株分別點(diǎn)接到脫脂牛奶培養(yǎng)基、纖維素培養(yǎng)基、果膠培養(yǎng)基、解鉀選擇培養(yǎng)基和固氮選擇培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，若有透明圈生成則具有相應(yīng)活性，使用CAS雙層平板檢測(cè)菌株產(chǎn)鐵載體能力^[17]。

種子液制備：挑取斜面保存的菌株SH-1471菌落接種于100 mL NB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后備用。

分別制備培養(yǎng)基A、培養(yǎng)基D、YSP、NYBD、NB和LB液體培養(yǎng)基各100 mL，以1%的接種量接種SH-1471種子液，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，3個(gè)重復(fù)，測(cè)量菌株發(fā)酵液的OD₆₀₀值。將菌株發(fā)酵液8 000 r/min離心2 min，并使用0.22 μm的無菌濾膜濾除菌體，采用發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)，驗(yàn)證菌株發(fā)酵液對(duì)番茄枯萎病菌的抑制效果，結(jié)合菌株發(fā)酵液OD₆₀₀值與發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制率篩選出最適培養(yǎng)基種類。    

以1.2.2篩選出的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基靶標(biāo)，設(shè)置單因素試驗(yàn)，分別加入碳源：麥芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、葡萄糖(glucose)、蔗糖(saccharose)和淀粉(starch)；氮源：氯化銨(NH₄Cl)、酵母浸粉(yeast extract)、硝酸銨(NH₄NO₃)、甘氨酸(glycine)、蛋白胨(peptone)、硝酸鈉(NaNO₃)和豆粉(bean flour)；無機(jī)鹽：碳酸鉀(K₂CO₃)、磷酸氫二鉀(K₂HPO₄)、碳酸鈣(CaCO₃)、氯化鈉(NaCl)、磷酸二氫鈉(NaH₂PO₄)和硫酸鎂(MgSO₄)。于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，測(cè)量菌株發(fā)酵液OD₆₀₀值和發(fā)酵液抑制率(同1.2.2)，以確定最佳碳源。

分別配制上述優(yōu)化的培養(yǎng)基100 mL，以pH：4.5、5.5、6.5、7.5和8.5，溫度：21、24、27、30、33、36和39 ℃，轉(zhuǎn)速：140、160、180、200和220 r/min為指標(biāo)，設(shè)置單因素試驗(yàn)，以1%的接種量接種SH-1471種子液，振蕩培養(yǎng)24 h后，測(cè)定不同培養(yǎng)條件下細(xì)菌生長(zhǎng)情況(OD₆₀₀)，以及發(fā)酵液對(duì)番茄枯萎病菌的抑制率(同1.2.2)，以確定最佳初始pH、溫度和轉(zhuǎn)速。

基于上述試驗(yàn)所得的最適配方條件，以菌株發(fā)酵液OD₆₀₀為指標(biāo)，選取蔗糖濃度(5、10、15、20和25 g/L)、豆粉濃度(5、10、15、20和25 g/L)和MgSO₄濃度(0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g/L)進(jìn)行優(yōu)化，使用Design-Expert 13軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，以進(jìn)一步得到適合菌株SH-1471的最適發(fā)酵條件。    

基于單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，以菌株發(fā)酵液的OD₆₀₀值為指標(biāo)，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株發(fā)酵液生物量的影響，在0?24 h內(nèi)每隔2 h測(cè)量一次，24 h后每隔12 h測(cè)量一次，直至120 h，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

病原菌經(jīng)PDB培養(yǎng)基28 ℃、180 r/min培養(yǎng)5?7 d后，稀釋成1.5×10⁷ CFU/mL孢子懸浮液；將菌株SH-1471用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件和優(yōu)化前的培養(yǎng)條件，分別培養(yǎng)20?24 h，稀釋成2×10⁸ CFU/mL菌懸液。采用灌根法接種菌液，用玻璃棒在番茄苗根莖約3 cm處扎孔，深約5 cm，每株100 mL病原菌懸液，待病原菌定殖3 d后接入等量的功能菌株菌懸液，每個(gè)處理10株，3個(gè)重復(fù)。以CK1 (滅菌培養(yǎng)基)與CK2 (病原菌+滅菌培養(yǎng)基)為對(duì)照，30 d后觀察并記錄發(fā)病情況，同時(shí)測(cè)量番茄植株株高、莖圍、根長(zhǎng)、根重和地上部鮮重和地上部干重。

將盆栽在恒溫條件下培養(yǎng)30 d，觀察并記錄植株生長(zhǎng)和發(fā)病情況。各處理發(fā)病情況按照番茄枯萎病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)^[18]，0：無癥狀；1：1片或2片葉子變黃；2：3片或者4片真葉變黃葉片萎蔫下垂；3：5片或6片真葉變黃或真葉萎蔫下垂；4：全株嚴(yán)重萎蔫以致枯死。

病情指數(shù)=(各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值)/(總株數(shù)×最高級(jí)值)×100

防效=(對(duì)照組病情指數(shù)?處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100

參照《伯杰氏系統(tǒng)分類手冊(cè)》^[19]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》^[20]中的方法對(duì)菌株SH-1471進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化特性檢測(cè)。

將菌株SH-1471接種至NB培養(yǎng)基中，33 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。采用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取菌株SH-1471的基因組DNA，采用16S rRNA基因序列27F (5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′)、1492R (5′-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3′)和gyrB基因序列g(shù)yrbBF2 (5′-GGGGTCTACTGCTTCACCAA-3′)、gyrbBR2(5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′)對(duì)菌株SH-1471進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：細(xì)菌DNA模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH₂O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，53 ℃ 60 s，72 ℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，委托北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST搜索(https://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)后與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬的基因序列進(jìn)行比較分析，選用同源性較高的模式菌株序列作為參比對(duì)象，用ClustalX 1.8軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，計(jì)算供試菌株與參比菌株序列的相似性。系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)排除堿基缺失位點(diǎn)，采用鄰接法(neighbor-joining analysis)用MEGA 7.0構(gòu)建供試菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，bootstrap值設(shè)定為1 000，其余均為默認(rèn)值。

數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，應(yīng)用Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)處理間差異顯著性。選擇Excel和SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析以及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并采用軟件Origin 2021和軟件GraphPad Prism 8制圖。

對(duì)菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)結(jié)果表明(圖1)，菌株SH-1471具有產(chǎn)srfA(1 300 bp)、fenB(1 600 bp)、ituA(1 047 bp)、ituD(647 bp)和bymA等抗生素合成基因，平板對(duì)峙試驗(yàn)以及發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株SH-1471對(duì)番茄枯萎病菌、煙草赤星病菌和玉米大斑病菌等8種病原微生物具有良好的抑制效果(圖2)，且對(duì)番茄枯萎病菌的抑制率最高，為96.59%。功能篩選結(jié)果可知，菌株SH-1471還具有產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、解磷、固氮和分泌鐵載體的能力(圖3)。綜上所述，該菌株不僅在作物病害生物防治方面具有極大的應(yīng)用前景，在促進(jìn)作物生長(zhǎng)提供土壤肥力等方面均具有廣闊的應(yīng)用前景。

七種培養(yǎng)基對(duì)菌株SH-1471的生長(zhǎng)的影響具有顯著差異(圖4A)，培養(yǎng)24 h后，SH-1471在培養(yǎng)基A、LB、NYBD、YSP和NA中的OD₆₀₀值分別為2.56、2.45、2.43、2.41和2.31，其中培養(yǎng)基A的OD₆₀₀值顯著高于其他配方；而培養(yǎng)基D和培養(yǎng)基YPG對(duì)菌株的生長(zhǎng)促進(jìn)作用最差，OD₆₀₀分別為1.46和1.98。且培養(yǎng)基A條件下，對(duì)病原物的抑制率最高，達(dá)82.4%，故選擇培養(yǎng)基A作為菌株SH-1471的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

由圖4B可知，當(dāng)添加蔗糖和葡萄糖為碳源時(shí)，菌株發(fā)酵液的OD₆₀₀值最高，分別為2.62和2.44，以麥芽糖為碳源時(shí)，OD₆₀₀僅為1.32；此外，以蔗糖為碳源時(shí)，菌株發(fā)酵液對(duì)番茄枯萎病菌的抑制率最高，達(dá)84.6%，綜合發(fā)酵液OD₆₀₀值與發(fā)酵液抑菌活性，以蔗糖作為菌株SH-1471的最佳碳源。對(duì)不同氮源篩選結(jié)果如圖4C所示，當(dāng)以豆粉為氮源時(shí)，菌株OD₆₀₀最高，達(dá)2.65，其次為酵母浸粉，為2.49，而氯化銨最低，僅為0.76，而以豆粉作為氮源時(shí)，菌株發(fā)酵液對(duì)病原物的抑制率為84.9%。綜合考慮，以豆粉作為菌株SH-1471的最佳氮源。如圖4D所示，當(dāng)以硫酸鎂和磷酸氫二鉀作為無機(jī)鹽源時(shí)，菌株發(fā)酵液OD₆₀₀值和抑制率均強(qiáng)于其他無機(jī)鹽源；當(dāng)以硫酸鎂作為無機(jī)鹽時(shí)，菌株發(fā)酵液OD₆₀₀值為2.61，抑制率為85.2%；以磷酸氫二鉀為無機(jī)鹽時(shí)，菌株發(fā)酵液OD₆₀₀值為2.45，抑制率為81.2%；而以碳酸鉀為無機(jī)鹽時(shí)，菌株發(fā)酵液OD₆₀₀值最低為1.54，抑菌率為73.6%。綜上所述，以硫酸鎂作為菌株SH-1471的發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳無機(jī)鹽。    

由圖5A所示，當(dāng)pH為4.5和8.5時(shí)，發(fā)酵液濃度顯著低于其他濃度梯度，OD₆₀₀值僅為2.11和2.22，表明pH值過高與過低均會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)。pH值為7.5時(shí)，發(fā)酵液OD₆₀₀值最高為2.65、發(fā)酵液對(duì)病原物的抑菌率最高為88.6%。綜上所述，菌株SH-1471的最適pH值7.5。由圖5B可知，當(dāng)溫度為33 ℃時(shí)，菌株發(fā)酵液OD₆₀₀值最高為2.67，抑菌率為86.5%。因此，確定菌株的最適發(fā)酵溫度為33 ℃。由圖5C可知，不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌株發(fā)酵液OD₆₀₀值和抑菌率具有不同的影響，當(dāng)轉(zhuǎn)速為220 r/min和200 r/min時(shí)發(fā)酵液OD₆₀₀值相似，但轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)，抑菌率較大，故以此為菌株發(fā)酵的最適轉(zhuǎn)速。

基于上述配方優(yōu)化結(jié)果，選取蔗糖濃度5–25 g/L、豆粉濃度5–25 g/L和MgSO₄濃度0.5–2.5 g/L 3個(gè)影響因素，采用Design-Expert 13進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行方差分析導(dǎo)出結(jié)果(表1)，得到菌株發(fā)酵液OD₆₀₀=3.02+ 0.10A+0.097B+0.05C?0.051AB?0.054AC+6.500E?003BC?0.13A²?0.14B²?0.093C²的回歸方程。從表可以看出，F值為0.026 4，P<0.05，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)差異不顯著，相關(guān)系數(shù)為0.965 4，說明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值具有較好的擬合度，試驗(yàn)誤差較小。CV值為3.47%，該模型R²Adj相關(guān)系數(shù)為0.921 0，響應(yīng)面變化可由該模型解釋，且與實(shí)際情況擬合較好，可用于試驗(yàn)分析預(yù)測(cè)。A、B、AC、BC、A²和B²均為差異極顯著(P<0.05)，其余項(xiàng)差異不顯著。根據(jù)F值大小，可以得出試驗(yàn)各因素對(duì)菌株OD₆₀₀值影響的順序?yàn)椋赫崽?gt;豆粉>MgSO₄。運(yùn)用Design-Export 13軟件分析得知菌株的最適條件為：蔗糖濃度為17.92 g/L、豆粉濃度為16.95 g/L、MgSO₄濃度為2.88 g/L，預(yù)測(cè)值為3.06，在該條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果分別為3.17、3.12和3.21，平均值為3.17，與預(yù)測(cè)值相近，表明優(yōu)化結(jié)果可靠(圖6)。

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果和響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，利用所得的最佳發(fā)酵配方及發(fā)酵條件進(jìn)行菌株最適發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化，結(jié)果如圖7所示，菌株SH-1471發(fā)酵液OD₆₀₀值總體呈“S”型變化，0–8 h時(shí)，發(fā)酵液OD₆₀₀值無顯著變化，為菌株生長(zhǎng)遲緩期，22 h時(shí)菌株發(fā)酵液OD₆₀₀值最大，為3.37。因此，8–22 h為菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌株生長(zhǎng)最快。22–120 h菌株生長(zhǎng)緩慢，趨于平穩(wěn)期。120 h之后，呈下降趨勢(shì)，為生長(zhǎng)的衰亡期。

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果和響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，利用所得的最佳發(fā)酵配方及發(fā)酵條件進(jìn)行連續(xù)3批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對(duì)比，結(jié)果如圖8所示，優(yōu)化后菌株發(fā)酵液的OD₆₀₀達(dá)到3.28，相比于優(yōu)化前提升36.7%；優(yōu)化后對(duì)病原物的抑菌率達(dá)到94.08%，相比于優(yōu)化前提升15.6%。綜上所述，發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果可靠，對(duì)菌株的生長(zhǎng)量及其對(duì)病原物的抑制率均具有較強(qiáng)的提高效果。

基于上述優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，30 d后測(cè)定各處理下的病情指數(shù)、發(fā)病率以及番茄幼苗的農(nóng)藝性狀。結(jié)果如表2和圖9所示，番茄幼苗經(jīng)過接種處理30 d，無論優(yōu)化前或優(yōu)化后，菌株均能有效抑制番茄枯萎病的發(fā)生，只接病原菌(CK1)的對(duì)照處理發(fā)病較為嚴(yán)重，病情指數(shù)高達(dá)79.8。菌株SH-1471優(yōu)化前的發(fā)酵液處理的番茄幼苗病情指數(shù)為4.6，防治效果為85.9%；優(yōu)化后的發(fā)酵液處理的番茄幼苗病情指數(shù)為2.2，防治效果為93.8%；此外，菌株SH-1471對(duì)番茄幼苗的生長(zhǎng)還具有一定的促生長(zhǎng)作用，與對(duì)照相比，經(jīng)菌株發(fā)酵液處理后，番茄幼苗的株高、莖圍、根長(zhǎng)、根重、地上部位鮮重和干重等農(nóng)藝性狀均得以顯著提高。

菌株SH-1471孢子呈桿狀，菌落中心呈乳白色，不產(chǎn)色素，菌落形狀不規(guī)則，邊緣呈放射狀，菌落表面粘稠，略微凸起(圖10)。生理生化鑒定結(jié)果表明，菌株革蘭氏染色均為陽(yáng)性，好氧生長(zhǎng)，能產(chǎn)生芽孢，接觸酶、硝酸還原反應(yīng)、精氨酸雙水解、V-P試驗(yàn)均為陽(yáng)性，可分解淀粉、使明膠水化、可利用葡萄糖和甘露醇，不可利用檸檬酸鹽，最低生長(zhǎng)溫度為3 ℃，生長(zhǎng)含鹽量范圍0%?9%，不具有產(chǎn)H₂S和分泌吲哚的活性。

基于16S rRNA基因擴(kuò)增，將菌株序列在NCBI上注冊(cè)，菌株序列登錄號(hào)為ON417363，經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)SH-1471分別與Bacillus velesiensis CR-502 (GenBank登錄號(hào)：AY603658)和Bacillus siamensis KCTC 13613 (GenBank登錄號(hào)：AJVF01000043)的同源性分別為99.8%和99.3%，利用鄰接法(neighbour-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，SH-1471與Bacillus velesiensis CR-502在同一分支上(圖11A)?；?/span>gyrB基因擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)SH-1471分別與Bacillus velezensis KACC 13105 (GenBank登錄號(hào)：JTKJ020000141)和Bacillus amyloliquefaciens DSM 7 (GenBank登錄號(hào)：ATCC 23350)同源性最高，分別為100%和99.2%，且與菌株Bacillus velezensis KACC 13105位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支(圖11B)，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果以及16S rRNA和gyrB基因檢測(cè)結(jié)果，最后將菌株SH-1471鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)：CCTCC No. M 2022923)。    

近年來，貝萊斯芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用越發(fā)廣泛。在已有的研究中，具有拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌常從水體、土壤、空氣、植物根系、植株表面和動(dòng)物腸道中分離得到^[1]。本文的研究對(duì)象貝萊斯芽孢桿菌SH-1471，分離自健康煙草根際土壤，本身對(duì)自然環(huán)境具有良好的適應(yīng)性，前人研究表明，貝萊斯芽孢桿菌可通過聚酮合酶合成途徑、核糖體途徑和非核糖體途徑合成脂肽類化合物、聚酮類化合物、細(xì)菌素和抑菌蛋白等活性物質(zhì)抑制病原物生長(zhǎng)^[21-23]。馮江鵬等^[24]研究的貝萊斯芽孢桿菌JK3菌株基因組中含有srfAA、bymB、fenD、bacA和ituC等脂肽類抗菌物質(zhì)生物合成相關(guān)基因。與之類似，本研究PCR結(jié)果表明，菌株SH-1471具有srfA、fenB、ituA、ituD和bymA等基因，可通過合成多種脂肽類抗生素抑制真菌、細(xì)菌的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)生物膜的形成。且貝萊斯芽孢桿菌SH-1471菌體以及無菌發(fā)酵液對(duì)番茄枯萎病菌均可起到良好的抑制效果，并可顯著提高番茄幼苗的株高、根長(zhǎng)以及根重等農(nóng)藝性狀。與陳萬權(quán)等^[25]分離自土壤的貝萊斯芽孢桿菌Jnb16的結(jié)果類似，該菌對(duì)水稻稻瘟病菌具有良好的抑制效果，且可有效促進(jìn)水稻植株的生長(zhǎng)。貝萊斯芽孢桿菌SH-1471除對(duì)番茄枯萎病菌具有良好的抑制效果，還對(duì)煙草赤星病菌、煙草炭疽病菌、玉米大斑病菌等病原微生物具有抑制效果。余水等^[26]分離的貝萊斯芽孢桿菌MT310亦具有廣譜抑菌性，對(duì)煙草赤星病菌、黃連根腐病菌和高粱炭疽病菌等植物病原真菌有明顯抑制效果。    

除生防作用外，貝萊斯芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用在工業(yè)以及生物醫(yī)學(xué)方面。貝萊斯芽孢桿菌SH-1471還具有產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶活性，對(duì)難溶性蛋白、植物纖維等具有良好的分解作用，在飼料添加劑、洗滌劑和造紙領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景^[27]。此外，菌株SH-1471具有解磷和固氮功能，可促進(jìn)土壤中難溶性化合物的降解，增加土壤中有效磷和可溶性氮的含量，對(duì)作物發(fā)芽率和作物根系生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，且對(duì)提高土壤肥力以及磷肥的利用率具有重要的作用^[28]。而菌株SH-1471的鐵載體合成能力也是誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性從而抵御病原菌的侵染的重要途徑，可通過分泌鐵載體來促進(jìn)植物根部系統(tǒng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取來促進(jìn)植物生長(zhǎng)，誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性等。    

此外，在菌株生長(zhǎng)過程中，往往伴隨著多種活性物質(zhì)和芽孢的產(chǎn)生，二者決定著菌株的生防活性以及菌株的抗逆性，但其通常與發(fā)酵條件息息相關(guān)，因此對(duì)菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化決定著菌株的生物量大小以及抑菌活性強(qiáng)度^[29]。前人研究表明，細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和外界條件都適宜的情況下，產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)往往較為豐富^[30]，枯草芽孢桿菌MC4-2的最適pH為6.0、轉(zhuǎn)速210 r/min、溫度32 ℃^[31]。本研究在該條件下，菌株生物量及抑菌活性均得以顯著提高。解淀粉芽孢桿菌HF-01的最適無機(jī)鹽為硫酸鎂，最適pH為微酸性至中性，培養(yǎng)溫度28 ℃^[32]，與本研究結(jié)果類似。桑樹內(nèi)生甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)XP-27最適無機(jī)鹽為硫酸鎂，培養(yǎng)溫度為30 ℃^[33]，這與本研究類似，但其最適初始pH值為8.0，而本研究最適pH為7.5，可能是由于菌株長(zhǎng)期生長(zhǎng)環(huán)境的不同而導(dǎo)致的^[34]。本研究通過室內(nèi)搖瓶對(duì)菌株培養(yǎng)基配方、發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果對(duì)菌株的生物量、拮抗活性及盆栽防效等均具有顯著的促進(jìn)作用。此外，平板對(duì)峙試驗(yàn)和室內(nèi)盆栽試驗(yàn)表明，發(fā)酵條件優(yōu)化后菌株SH-1471對(duì)番茄枯萎病菌的抑制作用和盆栽防效顯著提高至94.08%，盆栽防效提高至93.8%。但缺乏大型的發(fā)酵設(shè)備以及田間實(shí)際防效進(jìn)行驗(yàn)證，今后還需進(jìn)行小試和中試，以驗(yàn)證并完善優(yōu)化結(jié)果，進(jìn)一步獲得菌株的最適發(fā)酵罐發(fā)酵工藝，同時(shí)驗(yàn)證其是否還具有促生長(zhǎng)和誘導(dǎo)植物抗性等作用，為貝萊斯芽孢桿菌SH-1471的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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