熒光標記指將熒光物質(zhì)共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，具有無放射物污染、操作簡便、容易觀察等優(yōu)點，可借助熒光特性對被標記對象進行定性、定位以及定量分析。熒光標記在蛋白質(zhì)、核酸、細胞檢測及免疫分析等方面顯現(xiàn)出巨大潛能。

表 1. 常見的用于蛋白偶聯(lián)反應基團。

反應很多，本篇只講 NH₂ 和 SH 反應 ，在文章末尾小 M 會告訴大家基本的原理！在這里我們先來到大家最關注的環(huán)節(jié)：如何標記蛋白？以及使用過程中有哪些注意事項？

染料標記蛋白，主要包含以下步驟：

蛋白標記時蛋白溶液的配制，以下幾點十分重要！  

• 關于溶解：溶解蛋白時，要根據(jù)推薦的溶劑進行溶解，避免使用含伯胺 (例如 Tris，Glycine) 或銨離子的緩沖液，它們與待標記蛋白會發(fā)生競爭反應降低標記效率。低濃度的疊氮化鈉 (≤3 mM 或 0.02％) 或 Thimerosal (≤0.02 mM 或 0.01％) 不會顯著干擾蛋白標記，但是 20-50％ 的甘油會降低標記效率。

• 標記蛋白濃度：蛋白濃度過低會大大影響標記效率，一般濃度不小于 0.5 mg/mL。若蛋白濃度過低，可用超濾管濃縮蛋白。

注意事項：蛋白必須在不含伯胺和銨離子的緩沖液中，這些基團會和蛋白爭奪結合位點，會影響標記效率。

蛋白溶液配好了，我們現(xiàn)在開始配染料溶液，使用無水 DMSO 配制染料溶液 (多為 10 mM )，染料在 DMSO 穩(wěn)定性較好，剩余染料溶液可在 - 20℃ 分裝保存 1 個月。如果是水溶解，染料有易被水解的性質(zhì)，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

我們在標記時，首要注意的是染料和蛋白的配比問題，染料過少，反應不完全，標記量太少，染料過多，則不易純化。通常，我們推薦染料與蛋白的摩爾比在 5:1-20:1。
 

 案例：

此處我們以 CY3 為例，假如所需標記蛋白為 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000)，用 100 μL DMSO 溶解一管 1 mg CY3 染料，則所需 CY3 體積為 3.95 μL，詳細計算流程如下：

1)mmol(IgG)=mg/mL(IgG)×mL(IgG)/MW(IgG): 2 mg/mL×0.5 mL/ 150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol

2)mmol(CY3)=mmol(IgG)×10: 6.7×10-6 mmol×10=6.7×10-5 mmol

3)μL(CY3)=mmol(CY3)×MW(CY3)/mg/μL(CY3): 6.7×10-5 mmol× 590.15 mg/mmol/0.01 mg/μL =3.95 μL 

了解配比后，我們開始孵育，一般將染料和蛋白一起室溫孵育 2 h 即可完成結合！

熒光標記結束后，我們需要純化蛋白去掉多余未結合染料防止其對實驗的干擾，常用的純化工具為親和層析柱和透析袋。

表 2. 層析柱和透析袋的對比。

忙忙碌碌終于大功告成，那么如何檢測我們是否標記成功呢，通常是以下幾種：

• 直接肉眼觀察，根據(jù)上面的純化原理可以得知，如果得到的產(chǎn)物有顏色。我們默認標記成功；

• 熒光顯微鏡觀察，通過熒光顯微鏡在對應通道進行拍攝，如果觀察到特定形態(tài)熒光信號即為標記蛋白；

• 蛋白電泳實驗，標記后蛋白本身分子量會增大，蛋白存在微小向上拖帶可以證明標記成功（如果向下大范圍拖帶可能是蛋白發(fā)生降解）。

• 使用分光光度計測定 F（熒光素）和 P（抗體蛋白）的比值（F/P），F(xiàn)/P 的比值反映熒光蛋白的特異性染色質(zhì)量，一般要求 F/P 的克分子比值為1～3。過高時，非特異性染色增強；過低時，熒光很弱，標記效率低。

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下面是原理解答時間！

• · 關于蛋白氨基反應

伯胺 (-NH₂) 存在于每條多肽鏈的 N-末端 (稱為 α-氨基) 以及賴氨酸殘基的側鏈中(稱為 ε-氨基)。由于伯胺在生理條件下帶正電荷，因此它通常朝外，使得其更易于偶聯(lián)而不會使蛋白質(zhì)結構改變。從我們的表中可以看出，許多反應基團均可以和伯胺基結合，而在熒光標記中，最常用的是還是 NHS 活化酯 (SE)[1]。

圖 1. NHS 酯圖示。

NHS 活化酯 (SE)
NHS，全稱為 N -羥基琥珀酰亞胺酯，是 EDC (碳二亞胺) 活化羧酸分子形成的反應基團。帶有活化的 NHS 酯的交聯(lián)劑 和標記化合物在弱堿性條件下與伯胺反應， 產(chǎn)生穩(wěn)定的酰胺鍵 (圖 3)。該反應釋放 N-羥 基琥珀酰亞胺 (NHS)，可通過透析或脫鹽輕易去除[2]。

圖 2. NHS 反應圖示。

(R)表示具有 NHS 反應基團的標記試劑或交聯(lián)劑的一端; (P) 表示含有靶標功能基團 (即氨基，–NH) 的蛋白質(zhì)或其他分子。

• · 關于蛋白巰基反應

巰基 (-SH) 存在于半胱氨酸的側鏈中。在進行交聯(lián)反應時，必須將其還原成巰基，使其可以與大多數(shù)類型的反應基團進行交聯(lián)。巰基對馬來酰亞胺、鹵代乙?；瓦拎ざ€基具有反應活性，在蛋白巰基標記中，馬來酰亞胺的熒光探針最為常見[3]。

圖 3. 馬來酰亞胺圖示。

馬來酰亞胺（Maleimides） 
馬來酰亞胺是一種非常常用的反應活化基團，當反應混合物的 pH 值在 6.5-7.5 之間時，馬來酰亞氨基團會與巰基基團特異性反應，形成不可逆的穩(wěn)定硫醚鍵。在堿性更強的條件下（pH>8.5），支持伯胺偶聯(lián)，并且還會增加馬來酰亞氨基團水解成非反應性馬來酰胺酸的速率。馬來酰亞胺不與酪氨酸、組氨酸或蛋氨酸反應。需要注意的是，馬來酰亞胺酯是一種非活化染料，使用帶有馬來酰亞胺酯的熒光探針時，需用 DTT 活化后方可進行后續(xù)標記[4]。

圖 4. 馬來酰亞胺化學偶聯(lián)到巰基的反應圖式。

(R) 表示具有馬來酰亞胺反 應基團的標記試劑或交聯(lián)劑的一端; (P) 表示含有靶標功能基團 (即巰基，– SH) 的蛋白質(zhì)或其他分子。

[1] Mattson G, et al. A practical approach to crosslinking. Mol Biol Rep. 1993 Apr;17(3):167-83. 
[2] Grabarek Z, et al. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Anal Biochem. 1990 Feb 15;185(1):131-5.
[3] Staros JV, et al. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Anal Biochem. 1986 Jul;156(1):220-2.
[4] Timkovich R. Detection of the stable addition of carbodiimide to proteins. Anal Biochem. 1977 May 1;79(1-2):135-43.