20世紀(jì)70年代，Rizzetto等在乙型肝炎病毒(HBV)感染者中發(fā)現(xiàn)了一種新的RNA病毒，命名為delta，后證實為丁型肝炎病毒(HDV)^[1-2]。HDV是一種有缺陷的衛(wèi)星病毒，需借助HBV包膜蛋白完成病毒的組裝和復(fù)制，進(jìn)而建立新的感染^[3]。目前認(rèn)為HDV的感染主要有兩種模式，即共同感染和重疊感染。不同感染模式的患者預(yù)后存在一定差異^[4]。盡管HDV的致病機(jī)制尚不明確，但經(jīng)大量臨床隊列研究證實，HDV感染能夠引起非常嚴(yán)重的肝損傷，加速肝臟疾病進(jìn)展，增加肝硬化、肝臟失代償、肝癌甚至死亡的發(fā)生風(fēng)險^[5-6]。目前認(rèn)為有效的抗病毒治療能夠?qū)Σ《緩?fù)制產(chǎn)生一定抑制作用，對于改善臨床預(yù)后具有重要意義^[7]。本文將對HDV的復(fù)制周期以及抗病毒治療藥物的研發(fā)進(jìn)展作簡要綜述。

1HDV的感染模式

HDV的感染主要包括兩種模式^[8-9]，一種是HDV和HBV同時感染宿主，稱為共同感染；另一種是在乙型肝炎表面抗原(HBsAg)攜帶者或慢性HBV感染者中發(fā)生HDV感染，稱為重疊感染^[4, 8]。兩種感染模式的急性期和臨床表現(xiàn)具有顯著差異。HDV和HBV共同感染時，會激發(fā)宿主較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，感染者很少會進(jìn)展為慢性HDV感染(低于5%)^[9]，但急性共同感染較單獨HBV感染會導(dǎo)致更加嚴(yán)重的肝損傷，甚至?xí)?dǎo)致急性肝衰竭。而HDV的重疊感染很少出現(xiàn)自限性恢復(fù)，超過80%的重疊感染會進(jìn)展為慢性HDV感染^[10-11]。在重疊感染中，病毒學(xué)模式相對一致^[8, 12]。HDV病毒血癥出現(xiàn)較早，anti-HDV IgM和IgG反應(yīng)活躍。在重疊感染進(jìn)展為慢性感染過程中抗體滴度迅速升高，隨著病毒血癥的持續(xù)存在，二者維持在較高的滴度水平，而且在肝臟細(xì)胞內(nèi)能夠檢測到HDV抗原(HDAg)^[8, 12]。此外，在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)HDV可以在無HBV的情況下感染細(xì)胞并復(fù)制基因組^[13]，隨后發(fā)生HBV感染時，HDV完成病毒顆粒的組裝和釋放。在部分隊列中也發(fā)現(xiàn)患者未發(fā)生HBV感染^[14]，但可以檢測到HDAg，表明HDV存在單獨感染模式。盡管HDV感染會對HBV復(fù)制產(chǎn)生一定抑制作用，使HBV DNA滴度降低，但HDV感染可能改變肝細(xì)胞，誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答基因，從而導(dǎo)致宿主的疾病，使感染者依然表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的肝損傷^[6, 15]。由此可見，HDV可能具有獨特的肝臟侵害機(jī)制，靶向HDV感染開展抗病毒治療具有重要臨床意義。

2HDV的病毒復(fù)制

HDV為單股環(huán)形負(fù)鏈RNA病毒，外殼為嗜肝病毒的包膜蛋白，內(nèi)核為HDV RNA和HDAg。HDAg有兩種特異性的形式，分別為27 kD的L-HDAg和24 kD的S-HDAg，在HDV RNA的復(fù)制和病毒顆粒組裝中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用^[3]。

HDV感染細(xì)胞的主要過程如圖1所示，病毒顆粒首先附著在硫酸肝素蛋白多糖^[3, 16]，然后與?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)結(jié)合，經(jīng)過膜融合過程，將HDV的核糖核蛋白釋放到胞漿中，然后轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核，以滾環(huán)復(fù)制的機(jī)制進(jìn)行RNA的復(fù)制，合成新的基因組RNA^[17-18]。HDV基因組及反義基因組含有多個開放閱讀框，能夠用于蛋白的合成^[4]。病毒復(fù)制過程中，L-HDAg和S-HDAg也能夠轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制，或者連接到病毒基因組，形成核糖核蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿中^[3]。部分L-HDAg被異戊烯化(法尼基化)修飾，通過與HBsAg相互作用形成核糖核蛋白包膜而后由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑分泌至胞外，完成病毒的感染復(fù)制^[16]。目前，針對HDV復(fù)制過程中的關(guān)鍵步驟，如病毒的進(jìn)入、L-HDAg的修飾等^[16]，已開發(fā)多種靶向藥物并開展臨床試驗，為抗HDV感染的治療帶來了希望。

圖1  HDV的病毒復(fù)制過程

3HDV抗病毒治療藥物

HDV感染會引起最為嚴(yán)重的肝損傷，急需有效的抗病毒藥物和治療方案遏制疾病進(jìn)展。前期干擾素被廣泛推薦用于抗HBV和HDV感染的治療^[19]，但存在藥物副作用和治療后病毒反彈等問題^[20]。近幾年HDV靶向藥物的研發(fā)成果顯著，開展了多項抗HDV感染的藥物臨床試驗(表1)，2020年7月歐洲藥品管理局有條件批準(zhǔn)了進(jìn)入抑制劑Bulevirtide用于丁型肝炎的治療^[21]。此外，針對HDV復(fù)制過程的其他靶向藥物和增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的聯(lián)合治療方案也正在開展藥物臨床試驗。

3.1   干擾素治療

干擾素具有廣譜的抗病毒活性，可以分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三類。其中Ⅰ型和Ⅲ型干擾素用于開發(fā)慢性丁型肝炎的抗病毒治療。目前常用的IFNα或PEG-IFNα屬于Ⅰ型干擾素，國內(nèi)外已開展多項臨床試驗。在兩項較大的前瞻性臨床試驗^[22-23]中，僅有20%~30%的患者會出現(xiàn)持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答，且耐受性差，伴隨出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，聯(lián)合核苷類似物治療時，亦沒有顯著提高患者的病毒學(xué)反應(yīng)。當(dāng)抗病毒治療結(jié)束后，高達(dá)50%的HDV RNA陰性患者出現(xiàn)感染復(fù)發(fā)的情況^[24]。盡管如此，從近期一項長期隨訪的臨床試驗^[7]中能夠發(fā)現(xiàn)，PEG-IFNα治療顯著抑制或降低HDV RNA的水平，與改善臨床長期預(yù)后相關(guān)。因此選擇IFNα或PEG-IFNα進(jìn)行抗HDV感染治療，需要在可能發(fā)生的不良事件(流感癥狀、貧血和血小板減少等)與臨床治療效果之間進(jìn)行權(quán)衡^[2, 6]。目前新型長效型干擾素Ropeginterferon alfa-2b治療慢性丁型肝炎的臨床試驗正在開展(表1)。

PEG-IFNλ屬于Ⅲ型干擾素，其與Ⅲ型IFN受體結(jié)合，導(dǎo)致Jak-STAT信號通路的激活^[25]。由于Ⅲ型干擾素受體主要在肝細(xì)胞中表達(dá)，造血細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中表達(dá)較少，因此，與IFNα治療相比，產(chǎn)生的副作用較少，具有良好的開發(fā)前景^[26]。在LIMT HDV研究^[27]中顯示，慢性HDV感染者接受PEG-IFNλ單藥治療48周后，50%的患者能夠達(dá)到HDV RNA下降2 log₁₀以上或HDV RNA陰性，治療結(jié)束隨訪24周后，有36%的患者仍具有持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答，除高膽紅素血癥、肝酶指標(biāo)升高和流感樣癥狀外，其他不良事件較少。當(dāng)PEG-IFNλ聯(lián)合Lonafarnib和Ritonavir開展治療時^[28]，24周后96%的患者HDV RNA水平下降2 log₁₀以上，50%的患者HDV RNA水平低于檢測下限或無法檢測到，且安全性良好。目前PEG-IFNλ的三期臨床試驗正在開展(表1)。

3.2   進(jìn)入抑制劑治療

NTCP是HBV和HDV進(jìn)入肝細(xì)胞并建立感染的關(guān)鍵受體，靶向NTCP對于破壞病毒建立感染具有非常重要的作用^[3]。目前經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的NTCP代謝功能抑制類藥物包括Irbesartan、Ezetimibe、Ritonavir和環(huán)孢素A等^[29-30]。這些藥物經(jīng)體外細(xì)胞模型證實能夠有效阻斷HDV的感染或抑制HBsAg與NTCP的結(jié)合，但在臨床隊列中抗病毒治療效果有待證實^[29-30]。一項2期臨床試驗^[31]顯示，Ezetimibe(10 mg/d)作為單一療法，治療12周后并不能有效抑制患者的病毒載量，可能需要聯(lián)合其他靶向藥物或宿主免疫刺激藥物才能實現(xiàn)有效的抗病毒治療。

近期開發(fā)的靶向進(jìn)入抑制劑主要包括Bulevirtide及其前體藥物Myrcludex B^[16]，該類藥物是一種阻斷HBsAg preS1結(jié)構(gòu)域與NTCP結(jié)合的小肽，進(jìn)而阻止HDV建立感染，保護(hù)尚未感染的細(xì)胞，從而實現(xiàn)抗病毒功能。經(jīng)Ⅰb/Ⅱa期研究^[32]初步顯示，治療24周時，Myrcludex B或PEG-IFNα-2a或其聯(lián)合治療的隊列人群HDV RNA顯著下降。與單藥治療相比，聯(lián)合治療組的病毒學(xué)反應(yīng)更好，治療過程中也未發(fā)生嚴(yán)重不良事件，表明Myrcludex B耐受性良好，同時證實Myrcludex B和PEG-IFNα-2a對HDV有較強(qiáng)的協(xié)同作用。Ⅱ期臨床試驗顯示Bulevirtide耐受性良好，不良事件主要為輕度和短暫性中性粒細(xì)胞減少、血小板減少及嗜酸性粒細(xì)胞增多等^[33]。但Bulevirtide的抗病毒效果呈現(xiàn)出劑量依賴，Bulevirtide與PEG-IFNα聯(lián)合用藥具有顯著的協(xié)同抗病毒作用^[34-35]。2020年7月Bulevirtide已獲得歐盟批準(zhǔn)作為單一療法或與核苷(酸)類似物聯(lián)合用藥，用于慢性HDV感染者抗病毒治療，但推薦治療使用時間尚未確定^[21]。目前Bulevirtide正在全球多地慢性HDV感染者中開展抗病毒治療的Ⅲ期研究(表1)。

3.3   異戊烯化(法尼基化)抑制劑治療

L-HDAg的異戊烯化修飾是HDV病毒顆粒組裝成熟的關(guān)鍵步驟，抑制該修飾將破壞病毒的組裝，進(jìn)而降低功能性HDV病毒顆粒的釋放，是潛在的有效干預(yù)靶點^[3, 36]。目前研發(fā)的主要靶向藥物為法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑Lonafarnib，已經(jīng)開展了階段Ⅰ和Ⅱ期的臨床研究。2A期臨床試驗^[37]顯示，治療28 d后，低劑量組(100 mg)HDV RNA水平降低0.73 log₁₀，高劑量組(200 mg)降低1.54 log₁₀，呈現(xiàn)劑量依賴性。不良事件主要包括胃腸道副作用，如腹瀉和惡心，以及體質(zhì)量下降等^[37]。在LOWR HDV-1研究^[38]中，更高劑量的Lonafarnib(300 mg)更能降低HDV病毒載量，同時會增加胃腸道相關(guān)的不良事件發(fā)生頻率。當(dāng)?shù)蛣┝?100 mg)Lonafarnib聯(lián)合Ritonavir或PEG-IFNα治療時，抗病毒反應(yīng)效果更好，并且副作用較小^[28, 38]。在優(yōu)化治療方案中，三重聯(lián)合治療方案獲得了最佳的病毒學(xué)應(yīng)答，在治療結(jié)束時8/9的患者HDV RNA降低了2 log₁₀及以上^[39]。由此可見，盡管Lonafarnib單獨治療能夠顯著降低HDV病毒載量，但聯(lián)合Ritonavir或PEG-IFNα以及三種藥物聯(lián)合可以減少Lonafarnib的劑量，在保持抗病毒療效的同時減少胃腸道副作用^[28, 37-39]。目前Lonafarnib的三期臨床試驗正在開展(表1)。

3.4   核酸聚合物

核酸聚合物能夠抑制HBsAg包被的病毒顆粒組裝和釋放，因此也是一種潛在的抗HDV和HBV感染的方法^[40]。REP 2139是首個開展藥物臨床試驗用于HDV治療的核酸聚合物^[41]。12例患者經(jīng)REP 2139單藥治療15周，隨后REP 2139降低劑量聯(lián)合PEG-IFNα治療15周，然后PEG-IFNα單獨治療33周，研究^[41]結(jié)果顯示，在治療和隨訪期間HBsAg水平顯著下降，REP 2139單獨治療期，63.6%的患者HBsAg降低，隨訪期間有90.9%患者呈現(xiàn)下降趨勢。11例患者中有7例表現(xiàn)為HDV RNA陰性，實現(xiàn)HDV功能治愈。在這些患者中，3例表現(xiàn)出持續(xù)的HBV病毒學(xué)抑制，4例實現(xiàn)HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)化。持續(xù)隨訪3.5年后^[42]，僅2例病毒學(xué)反彈的患者出現(xiàn)ALT輕微升高，沒有觀察到其他安全性或耐受性問題。REP 2139表現(xiàn)出良好的可耐受性，與PEG-IFNα聯(lián)合的治療方案為HDV功能治愈、HBV病毒學(xué)控制/功能治愈和HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)化提供了選擇。

3.5   RNA干擾療法

RNA干擾療法利用小干擾RNA分子(siRNA)靶向沉默病毒共價閉合環(huán)狀DNA的RNA轉(zhuǎn)錄本，從而抑制病毒蛋白的產(chǎn)生。因此推測siRNA能夠清除HBsAg，進(jìn)而抑制HDV的感染。ARC-520是第一種靶向HBV轉(zhuǎn)錄本的RNA干擾療法，已在HBV單感染患者中開展臨床試驗^[43]，聯(lián)合核苷(酸)類似物，高劑量組(2 mg/kg)ARC-520能夠顯著降低患者HBsAg水平，治療結(jié)束后仍可維持對HBV的抑制療效。僅觀察到2例可能與研究藥物有關(guān)的發(fā)熱，表明ARC-520耐受性良好^[43]。除此之外，該公司還研發(fā)出升級后的siRNA，即JNJ-3989也能夠用于HBV感染的治療，一項Ⅱa期研究^[44]顯示，40例患者每月接受不同劑量的JNJ-3989聯(lián)合核苷酸類似物治療3個月，治療期間HBsAg水平迅速下降，39例患者HBsAg較基線下降1.0 log₁₀，56%的患者在末次給藥后9個月內(nèi)HBsAg持續(xù)下降，其不良事件多為注射部位反應(yīng)。該研究表明JNJ-3989短期治療也可持續(xù)抑制HBsAg。目前JNJ-3989在HBV/HDV合并感染的患者中安全性和有效性的Ⅱ期臨床試驗正在進(jìn)行(表1)。盡管siRNA對于改善感染者HBsAg水平表現(xiàn)良好，但臨床試驗中仍需采用與核苷酸類似物聯(lián)合的治療方案。

3.6   中藥治療

早期研究^[45-46]顯示，中藥單獨或中藥與IFNα聯(lián)合用藥對HBV/HDV重疊感染者具有一定收益，如小柴胡湯治療方案和IFNα配伍活血化瘀保肝中草藥治療^[46]。86例HDV抗體陽性的乙型慢性活動性肝炎患者隨機(jī)分為3組，分別應(yīng)用小柴胡湯、聯(lián)苯雙酯和小柴胡湯與聯(lián)苯雙酯聯(lián)合治療，經(jīng)過3個月的治療后，小柴胡湯能夠使90.9%的患者ALT水平恢復(fù)正常，HBsAg均有不同程度的下降，表現(xiàn)出良好的治療效果^[46]。不僅如此，IFNα配伍活血化瘀保肝中草藥治療HBV/HDV重疊感染者^[45]，1個月后患者ALT水平全部恢復(fù)正常，療程結(jié)束后HBeAg陰轉(zhuǎn)率為65%，HBV DNA檢出率也顯著下降，表明IFNα配伍活血化瘀中草藥的治療方法成果顯著。由于該研究方案以葡萄糖、維生素C和氨基酸等常規(guī)保肝藥為對照，因此，治療方案中IFNα可能主要起到抗病毒作用，而活血化瘀類中草藥主要功能可能是改善肝臟微循環(huán)，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，調(diào)節(jié)免疫功能等^[45]。由此可見，抗病毒治療藥物與免疫調(diào)節(jié)藥物聯(lián)合用藥對HBV/HDV重疊感染者肝功能的恢復(fù)具有顯著療效。

4小結(jié)與展望

盡管乙型肝炎疫苗的實施能夠有效降低HDV的感染率^[47]，但由于移民遷移、HIV感染以及靜脈吸毒等風(fēng)險因素^[48-50]，使全球部分地區(qū)HDV的感染率仍處于較高水平^[51-52]。預(yù)計全球HDV感染者有4 800萬~7 400萬^[51-54]。15%的慢性丁型肝炎患者會在1~2年發(fā)展成肝硬化^[55]，70%~80%的患者在5~10年發(fā)展成肝硬化，30年后肝硬化發(fā)生的風(fēng)險提高到77%^{[4, 53, 55]}。對慢性丁型肝炎患者實施有效的抗病毒治療迫在眉睫。

隨著研究的深入，HDV病毒復(fù)制及其致病機(jī)制漸趨明朗，為靶向藥物的研發(fā)提供了堅實基礎(chǔ)。2020年進(jìn)入抑制劑Lonafarnib的獲批，給更多新藥研發(fā)提供了動力，也為丁型肝炎患者的抗病毒治療帶來了希望。由目前開展的藥物臨床研究可以看出，靶向藥物聯(lián)合干擾素，靶向藥物聯(lián)合核苷酸類似物，以及三種藥物聯(lián)合治療，可協(xié)同提高抗病毒活性，降低單藥的毒副作用，避免可能出現(xiàn)的耐藥問題，對臨床抗病毒治療更有意義。