高等真核生物基因組存在復雜的三維空間結(jié)構(gòu)，在不同尺度下形成如染色質(zhì)環(huán)（Chromatin loops）、拓撲關聯(lián)結(jié)構(gòu)域（TADs)、活性/非活性染色質(zhì)區(qū)室（A/B compartments）和染色體域（Chromosome territories）。這些結(jié)構(gòu)對于基因組穩(wěn)定性的維持、基因表達的精準調(diào)控具有重要作用，從而影響細胞命運決定和表型建立。經(jīng)典的基因組三維結(jié)構(gòu)主要通過染色體構(gòu)象捕獲（3C）及其衍生方法如4Cs、5C、Hi-C、ChIA-PET為代表的多種形式的高通量技術揭示。這些技術可以捕獲細胞核內(nèi)空間相鄰的成對DNA序列，但無法捕獲細胞群體中基因組內(nèi)協(xié)同的多位點相互作用（multi-way contact）和單分子拓撲結(jié)構(gòu)（single-allele topology）。此外，基因組3D結(jié)構(gòu)在細胞周期、發(fā)育和分化過程中動態(tài)變化，且與多個基因及調(diào)控區(qū)間的染色質(zhì)相互作用相關。獲得細胞群體中的染色體單分子拓撲結(jié)構(gòu)對于探究基因組的動態(tài)折疊機制和與基因調(diào)控功能的關聯(lián)性頗為重要。  

近年來，多個實驗室建立了如ChIA-drop、split-pool recognition of interactions by tag extension（SPRITE）、Tri-C、multi-contact 4C和Pore-C等方法，用于探討染色質(zhì)多位點協(xié)同相互作用和群體細胞的染色體單分子拓撲結(jié)構(gòu)的捕獲。這些方法中，Pore-C具有技術簡單，且可以同步捕獲全基因組高階多位點互作信息和DNA甲基化修飾的優(yōu)點。 

中國科學院昆明動物研究所研究員侯春暉團隊與中山大學中山眼科中心副研究員肖傳樂團隊合作，在《自然-通訊》（Nature Communications）上，發(fā)表了題為High-throughput Pore-C reveals the single-allele topology and cell type-specificity of 3D genome folding的研究論文。該工作優(yōu)化建立了高通量的Pore-C方法，顯著增加了高階染色質(zhì)互作的檢測通量，并揭示了三維基因組的單分子拓撲結(jié)構(gòu)多樣性和細胞特異性。

研究發(fā)現(xiàn)，Pore-C技術測序通量相對較低的原因可能是與DNA交聯(lián)的蛋白質(zhì)沒有被完全去除而導致測序納米孔芯堵塞。為了解決這一問題，研究優(yōu)化了酶解條件，測試了多次蛋白酶解和使用混合蛋白酶的策略，提高了測序產(chǎn)量約80%，近乎成倍降低了該技術的使用成本。此外，研究通過整合NGMLR和Minimap2比對算法開發(fā)了MapPore-C比對流程，顯著改善了比對準確性和數(shù)據(jù)利用率低的問題，同時，研究通過與Hi-C數(shù)據(jù)比較，驗證了HiPore-C能夠高度重現(xiàn)基于Hi-C捕獲的染色質(zhì)環(huán)、拓撲相關結(jié)構(gòu)域和染色質(zhì)區(qū)室等基因組3D結(jié)構(gòu)。進一步，研究探索了染色體間高階互作發(fā)現(xiàn)，多數(shù)互作并非發(fā)生在端粒和中心粒之間，而是發(fā)生在基因組區(qū)域，且形成兩個轉(zhuǎn)錄活性不同的互作樞紐，其中一個樞紐基因密度、增強子密度和活躍狀態(tài)染色質(zhì)相關的表觀遺傳修飾水平均更高。研究還發(fā)現(xiàn)，多個染色體的tRNA基因富集區(qū)域之間發(fā)生跨染色體的高頻相互作用，HiPore-C高階互作不僅發(fā)生在TAD和compartment內(nèi)部，而且能夠跨越多個區(qū)室、拓撲相關域和染色質(zhì)環(huán)，基于直接和間接的DNA片段間相互作用構(gòu)建的染色質(zhì)互作圖譜與常規(guī)Hi-C圖譜總體相似，但間接DNA片段互作更加傾向跨越多個結(jié)構(gòu)單元。上述研究揭示了跨染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域互作存在的廣泛性，并突出了HiPore-C技術在單分子水平解析基因組三維高階互作的優(yōu)勢和重要性。 

研究通過分層聚類的方法，討論了不同類型細胞的拓撲結(jié)構(gòu)中呈現(xiàn)的單分子拓撲結(jié)構(gòu)集群。這些結(jié)構(gòu)集群是類亞TAD（subTAD-like）結(jié)構(gòu)域形成的基礎，具有明顯的細胞特異性，表明單分子拓撲結(jié)構(gòu)多樣性是細胞群體TAD結(jié)構(gòu)域劃分的基礎，對探討基因組空間結(jié)構(gòu)組織和細胞特異的基因表達間的關系具有重要意義。此外，研究使用HiPore-C數(shù)據(jù)比較了紅系K562和淋巴系GM12878細胞中在β-globin locus的高階互作。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人ε-和γ-珠蛋白基因啟動子和多個增強子之間形成了多位點同時互作、細胞特異的增強子-啟動子中心，這種相互作用可能是動態(tài)的。研究分析了HiPore-C同時捕獲染色質(zhì)高階互作和DNA甲基化狀態(tài)的能力，發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化信號與染色質(zhì)環(huán)錨點間相互作用強度呈正相關，此外，可根據(jù)DNA甲基化水平準確地區(qū)分染色質(zhì)區(qū)室的類型（A vs B）。

該研究建立了HiPore-C技術，可全面描述單分子拓撲結(jié)構(gòu)的多樣性，揭示的單分子拓撲結(jié)構(gòu)的動態(tài)折疊比以前想象的更為復雜，進一步提升了關于三維基因組折疊規(guī)律的認知。

圖1.用于生成高階染色質(zhì)相互作用的原位HiPore-C協(xié)議示意圖