【原】干貨｜菌（毒）種鑒定指導(dǎo)原則與鑒定方法

閱微基因 2023-01-16 發(fā)布于北京

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菌毒種

系指直接用于制造和檢定生物制品的細菌、真菌、支原體、放線菌、衣原體、立克次體或病毒等，包括各種經(jīng)過基因工程修飾的菌毒種。

——生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制《中國藥典》2020年版

菌毒種作為重要的實驗材料被廣泛應(yīng)用于診斷試劑、藥物篩選、疫苗及生物制品研發(fā)等領(lǐng)域，其質(zhì)量直接影響科研及生產(chǎn)結(jié)果的準確性，若使用的菌毒種有誤或者存在污染，將對結(jié)果造成嚴重影響；因此，菌毒種資源所對應(yīng)的信息準確、完整與否，亦是生物制品質(zhì)量審評的重要關(guān)卡。

《中國藥典》規(guī)定，生物制品生產(chǎn)用菌毒種應(yīng)采用種子批系統(tǒng)，并應(yīng)盡量減少傳代次數(shù)，以降低發(fā)生遺傳變異的風(fēng)險。工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴格控制，不得超過5代（從菌種保藏機構(gòu)獲得的標準菌株為第0代）；原始種子應(yīng)驗明其歷史、來源（包括重組工程菌毒種的構(gòu)建過程）和生物學(xué)特性。美國藥典（USP）部分標準要求從保藏機構(gòu)獲取的菌毒種傳代不能超過5代。美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）-M22-A3要求不能超過7代。

開展菌毒種質(zhì)量控制，對生產(chǎn)用菌毒種進行生物學(xué)特性、生化特性、血清學(xué)試驗和分子遺傳特性等的檢定，確保生產(chǎn)用菌毒種的檢定符合各論要求。

生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制《中國藥典》2020年版

以下主要介紹菌毒種鑒定中的分子生物學(xué)方法。

菌毒種鑒定

表型特征方法

表型微生物鑒定依據(jù)表型特征的表達來區(qū)別不同微生物間的差異，通過比較微生物的菌落形態(tài)、理化特征和特征化學(xué)成分與典型微生物的差異進行鑒別。

表1 微生物分類中常用的表型特征

菌毒種鑒定

分子生物學(xué)方法

與表型特征不同，應(yīng)用分子生物學(xué)方法通常不受生長培養(yǎng)基或分離物活性的影響，只需分離到純菌落便可用于分析。由于大部分微生物物種中核酸序列是高度保守的，所以16S rRNA核酸測序、18S rRNA核酸測序、ITS核酸測序和全基因組核酸測序等“系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)”鑒定方法理論上更值得信賴。

表2 微生物分類學(xué)的基因型/系統(tǒng)發(fā)育的特征

細菌16S rRNA基因序列和真菌的ITS核酸序列在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度保守性，是微生物核酸測序鑒定和分類中廣泛應(yīng)用的DNA特征性核酸序列，方法易標準化，鑒定結(jié)果可以滿足一般菌種鑒定的要求。對16S rRNA（全長約1500bp）和ITS（ITS1與ITS2）全長序列進行PCR擴增，電泳分離擴增產(chǎn)物后純化，純化產(chǎn)物使用sanger法進行序列測定，然后與公用數(shù)據(jù)庫（NCBI）進行比對，進行菌種鑒定。

不過16S rRNA等標簽基因，一般能夠鑒定到種的級別，若是確認同種中的兩個相同株需要比對更多的基因序列或特征基因片段，甚至是全基因組序列的比對來保證結(jié)果的準確性。

16S F端測序峰圖示例

16S R端測序峰圖示例

序列比對結(jié)果

全基因組核酸測序可以得到菌株核酸水平的全部遺傳信息，通過核酸序列的比對分析，進行菌株的鑒定、功能挖掘及安全性評價等分析。2020 版《中國藥典》人用基因治療制品總論要求應(yīng)保證起始原材料的遺傳穩(wěn)定性，并基于細胞庫/種子批經(jīng)長時間培養(yǎng)或多次傳代后產(chǎn)物的完整性和一致性。在特定情況下因某些位點產(chǎn)生突變造成序列與理論不符，應(yīng)提供不影響目的基因表達和制品質(zhì)量的證據(jù)。全基因組核酸序列檢測方法對遺傳變異的分析能夠及時發(fā)現(xiàn)尚未導(dǎo)致表型改變、但核酸已發(fā)生變異的情況，從而進行處置，避免因菌毒種變異而影響實驗活動。

食品和飼料安全基因組學(xué)跨機構(gòu)合作組織編寫的“Use of Whole Genome Sequencing by the Federal Interagency Collaboration for Genomics for Food and Feed Safety in the United States”描述了美國國立衛(wèi)生研究院、衛(wèi)生與公眾服務(wù)部、疾病控制和預(yù)防中心（CDC）和美國食品和藥物管理局（FDA），以及美國農(nóng)業(yè)部、食品安全和檢驗局、農(nóng)業(yè)研究局和動植物衛(wèi)生檢驗局之間的食源性病原體分析、調(diào)查和協(xié)調(diào)工作。指出使用單核苷酸多態(tài)性（SNP）方法評估基因內(nèi)（編碼）和基因間（非編碼）的變異，根據(jù)廣義的法則與WGS數(shù)據(jù)比對，≤20 SNPs 用于判定是否為同一菌株，且FDA在其GenomeTrakr nerwork中也是基于SNP的方法進行菌株鑒定。

閱微基因菌毒種鑒定-全基因組測序方法，將待檢樣本與參考樣本比對，統(tǒng)計兩者間SNP/突變位點數(shù)量并判定是否為同一株系（≤20 個SNP位點判定為同一株系來源，>20個SNP位點判定為非同一株系）?？山邮諛颖绢愋蜑楹怂崤c菌種沉淀，病毒類樣本鑒定只接收核酸。

對SNP/突變位點的注釋，輔助判定突變是否會影響表達產(chǎn)物：

菌毒種的鑒定應(yīng)根據(jù)實際的需求以及所要達到的鑒定水平（屬、種、株），選擇最適合要求的鑒定技術(shù)，必要時可采用多種鑒定方法進行確認。

質(zhì)量控制是產(chǎn)品安全、有效的重要保證和產(chǎn)業(yè)化進程中的重要環(huán)節(jié)之一，閱微基因可提供細胞特性、功能性、純度、安全性等分析，從藥典推薦方法到快速檢測方法滿足不同階段的研發(fā)需求，同時為研發(fā)型藥企及CXO企業(yè)提供從質(zhì)控、基因分析到臨床基因分型方法的驗證開發(fā)。

閱微基因質(zhì)控檢測項目表