【原】干細胞或其外泌體：在新冠治療中哪個更受青睞？

干細胞與外泌體 2022-12-30 發(fā)布于廣東

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此前未知的冠狀病毒引起的肺炎，僅用了8個月的時間就演化為影響空前深遠的全球大流行病。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的治療措施為評估間充質(zhì)干細胞及其細胞外囊泡 (EV)，尤其是外泌體的潛力提供了新的機會。那么干細胞或其外泌體：在新冠治療中哪個更受青睞？

2020 年 2 月，世界衛(wèi)生組織 (WHO) 確定冠狀病毒 (SARS-CoV-2) 是導致 2019 年大流行性冠狀病毒病 (COVID-19) 的罪魁禍首，感染 SARS-CoV-2 的患者會出現(xiàn)多種癥狀，從輕微的普通感冒到嚴重的急性呼吸系統(tǒng)疾病以及隨后的死亡，盡管現(xiàn)在有幾種有效的疫苗可用于對個人進行免疫，但每天都會發(fā)現(xiàn)有關 SARS-CoV-2 病毒的結構、致病性、傳播系統(tǒng)和免疫特性的新事實，這促使世界各地的科學家繼續(xù)研究所有可能的治療策略來治療感染人群。

目前可用的治療方法

在這次冠狀病毒全球緊急事件中，對抗 COVID-19 的第一個醫(yī)療策略是使用抗生素和抗病毒藥物來阻止病毒復制周期并抑制宿主炎癥。這種策略主要導致支持和對癥治療，在某些情況下甚至出現(xiàn)有希望的結果，但不是這種感染的最終治療方法。例如，托珠單抗（IL-6 受體阻滯劑）、阿達木單抗（抗 TNF 抗體）和依庫珠單抗（抗 C5 抗體）等免疫調(diào)節(jié)干預措施可以有效緩解患者癥狀，但無法根本治愈。

在抗病毒藥物中，氯喹（CQ）及其衍生物羥氯喹（HCQ）既便宜又安全。它們的藥代動力學特性也已被批準用于治療瘧疾等病毒感染。除了抗病毒活性外，CQ 還充當抗炎劑，可治療自身免疫性疾病，包括類風濕性關節(jié)炎。迄今為止，已有二十多項臨床試驗（全部在中國進行）檢驗了 CQ 對 COVID-19 患者的影響。

SARS-CoV-2 感染體外模型的研究結果表明，洛匹那韋-利托那韋組合形式比單獨使用任何一種形式更有效。另外兩種藥物 Nafamostat 和 camostat 在日本已被批準用于治療胰腺炎，因為它們抑制絲氨酸蛋白酶，包括細胞外蛋白酶 TMPRSS2。

此外，世界各地的科學家和研究人員對硝唑尼特、伊維菌素、皮質(zhì)類固醇、托珠單抗和 Sarilumab 等大量藥物以及許多其他未知或鮮為人知的藥物進行了研究，希望找到一種有效的治療 COVID-19 的方法。

另一種潛在的治療方法是基于細胞的療法?，F(xiàn)在已經(jīng)證明，間充質(zhì)干細胞 (MSC) 在治療肺損傷方面具有顯著的治療優(yōu)勢。

除了 MSCs 之外，不同的免疫細胞，如自然殺傷 (NK) 細胞、樹突細胞 (DC)、T 細胞和細胞因子誘導的殺傷 (CIK) 細胞以及分泌的外泌體也已被評估，并發(fā)現(xiàn)它們具有有益的作用由傳染性和非傳染性病原體介導的肺部病理狀況。

在各種細胞來源中，MSC 及其外泌體的治療功能在不同的急性和慢性肺病模型中得到一致報道，這可以支持它們用于治療 COVID-19 誘發(fā)的肺炎/ARDS 患者。

基于 MSC 的治療 COVID-19 的潛力

上海大學生命科學學院等研究團隊在 2020 年 3 月的報告中首次證實了移植的 MSCs 在改善 COVID-19 患者肺功能方面的治療潛力（下圖）。

許多后續(xù)的臨床和臨床前研究評估了 MSCs 治療 COVD-19 能力的有效性、安全性和各個方面。關于將 MSCs 應用于 ARDS 患者的 I/II 期臨床研究取得了令人鼓舞的結果，這鼓勵了使用 MSCs 治療 COVID-19 的各種臨床試驗。

表1列出了已完成的臨床研究的詳細信息：

NHPBSC非造血外周血干細胞、MSC間充質(zhì)干細胞、UC臍帶、BM骨髓、NA不適用、鼻內(nèi)、iv靜脈、EV細胞外囊泡

表 1 截至 2021 年 4 月在 Clinicaltrials.gov 注冊的針對 COVID-19 的 MSC 或 EVs 治療的已完成臨床研究的詳細信息

鑒于MSC其獨特的特性，包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)和組織再生能力，MSC 在治療 COVID-19 感染方面的成功也就不足為奇了。此外，在第一個 AETHER 試驗中證明了 MSCs 靜脈注射到特發(fā)性肺纖維化患者后的人同種異體骨髓的安全性，為使用 MSCs 治療呼吸系統(tǒng)疾病患者提供了基礎。此外，在 ARDS 患者中施用 MSCs 的安全性已在三個早期完成的臨床試驗中得到證明。

近幾十年來，MSCs 用于治療不同階段的呼吸系統(tǒng)疾病的候選資格導致其可能機制的揭示。例如，MSCs 的抗炎和抗凋亡作用通過誘導上皮細胞和內(nèi)皮細胞的修復改善肺功能，并增強幾種 ARDS 模型中肺泡水腫液的清除。MSC 能夠分泌抗炎細胞因子（IL-10 和 TGF-β），導致中性粒細胞向受損器官募集減少，促炎細胞因子（TNF-α、IL-8、IL -6)。

這種功能（分泌抗炎劑）是 MSC 旁分泌活動的一部分，使它們能夠管理周圍細胞的功能，包括免疫細胞（巨噬細胞和 T 細胞）和非免疫細胞（肺泡上皮細胞）。此外，間充質(zhì)干細胞通過轉移線粒體直接與各種免疫細胞相互作用，從而避免它們的增殖以及將它們的表型改變?yōu)榭寡谞顟B(tài)，直接通過隧道納米管（TNT）或間接地通過分泌的細胞外囊泡。

MSCs分泌多種生長因子，包括成纖維細胞生長因子-β（FGFb）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），不僅能顯著抑制細胞凋亡和減少氧化損傷，還能誘導細胞增殖和遷移。上皮和內(nèi)皮細胞再生和替換肺纖維化中受損的細胞。這些特性可能對 COVID-19 患者的康復有用，分布肺泡通透性和過度中性粒細胞浸潤一再被報道為 COVID-19 大流行的標志性病理生理學特性。

Angiopoietin-1 存在于分泌的可溶性因子 MSC 中，通過細胞骨架重組和預防肺泡上皮 II 型細胞中的 NF-κB 活性，改善肺泡屏障完整性并恢復炎癥誘導的上皮蛋白通透性。

MSC 的作用機制人們普遍認為很大一部分是由旁分泌因子的分泌介導的。研究人員已經(jīng)觀察到 MSCs 旁分泌機制的工作作用，以幫助改善動物模型的氣道炎癥。由 MSC 分泌的可溶性介質(zhì)包括細胞因子、生長因子、miRNA 以及外泌體，它們與親本細胞具有相似的功能，決定了它們的特性。

MSC 衍生的外泌體對 COVID-19 的治療潛力

外泌體是納米尺寸的膜囊泡，尺寸范圍在 30-150 nm 之間。它們由許多細胞類型分泌到各種體液中。

在生理和病理條件下，外泌體通過將各種生物分子（如 miRNA 和蛋白質(zhì)）運輸?shù)桨屑毎?，在細胞間通訊中發(fā)揮關鍵作用。與源自細胞表面的凋亡小體和微泡不同，外泌體由內(nèi)體途徑產(chǎn)生，并加載原始細胞的細胞質(zhì)內(nèi)容物。

因此，它們是原始細胞的迷你版，模仿了它們的所有特性。外泌體是 MSC 分泌的關鍵旁分泌效應物之一，并且由于它們的生物物質(zhì)類似于親代細胞，并且具有保持愈合特性的能力，因此它們被認為是替代 MSC 治療各種疾病的有吸引力的候選者。

與細胞對應物相比，外泌體的無毒性、低免疫原性、高穩(wěn)定性、易于儲存以及作為現(xiàn)成產(chǎn)品生產(chǎn)的潛力是外泌體的幾大優(yōu)勢，這導致它們作為新的治療替代品擴大了臨床應用。

此外，外泌體的天然功能使它們能夠通過質(zhì)膜融合將其膜和細胞質(zhì)生物活性成分從原始細胞遞送至靶細胞。

還有其他獨特的特性，包括自由穿越血腦屏障 (BBB) 等生物屏障的天然能力。此外，生物相容性是另一個特點。由于其源于生物來源和內(nèi)在的靶向能力，外泌體已被用作臨床前研究中藥物成分的運載工具。

外泌體的這些獨特特性增加了與 MSC 相關的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，引入源自 MSC 的外泌體作為治療干預的有趣工具，以應對當前的 COVID-19 大流行情況。MSC-外泌體可能與親本細胞機制不同或相似，可以防止過度反應性免疫反應引起的細胞因子風暴，并促進損傷肺的內(nèi)源性修復。

MSC 來源的外泌體對肺部炎癥的影響

MSC 衍生的外泌體從其親本細胞繼承了免疫抑制特性。MSC-外泌體可能使用了多種機制來平衡免疫系統(tǒng)的功能。關鍵機制之一是重新編程和改變各種免疫細胞的表型。例如，MSC 衍生的外泌體促進肺泡巨噬細胞存活并將其表型從促炎 (M1) 極化轉變?yōu)榭寡?(M2) 極化的能力已被至少兩項研究證實。這些發(fā)現(xiàn)的含義是外泌體可以成為其親本細胞的可行替代品。

這種能力也被報道用于 MSC，它可以改變 Treg/Teff 比率以增加 Treg，并促進抗炎細胞因子的分泌。

不同的研究發(fā)現(xiàn)，急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）炎癥環(huán)境中的 MSC-外泌體負責巨噬細胞的重編程，以減少作為主要促炎細胞因子的 TNF-α 和 IL-8 的產(chǎn)生，巨噬細胞的 M1-M2 極化以及改善它們的吞噬作用和氧化磷酸化。

MSCs 引起靶細胞功能調(diào)節(jié)的另一種機制依賴于通過外泌體介導的 microRNAs 轉移進行的基因表達調(diào)節(jié)。如前所述，外泌體可以根據(jù)其特定的生物活性分子改變靶細胞的功能。

MSC-外泌體中存在微小 RNA，例如 miR-34a、miR-122、miR-124、miR-127、miR-146a 和 miR-195，它們在誘導與 MSC 相關的免疫調(diào)節(jié)特性方面具有重要作用等。

例如，MSC 外泌體中過表達的 miR-122 通過敲低其靶基因（包括細胞周期蛋白 G1 和胰島素樣生長因子受體 1）來增加血腫細胞的化學敏感性，并觸發(fā)細胞凋亡和細胞周期停滯。

miR-34a 是一種主要的抑癌 miRNA，能夠調(diào)節(jié)腫瘤進化和癌癥進展中的關鍵基因，例如 BCL2、MYC、CDK4/6、NOTCH1、MET 和 CD44。顯示 MiR-146，一種眾所周知的抗炎 miRNA，選擇性地包裝到源自 MSC 的外泌體中，并可誘導巨噬細胞向 M2 表型發(fā)展。

此外，MSC-外泌體攜帶環(huán)氧合酶 (COX)-2 酶的高水平 mRNA，可誘導前列腺素 E2 (PGE2) 的產(chǎn)生。PGE2 被認為是將巨噬細胞的 M1 表型轉換為 M2 表型的關鍵。

全身施用曲霉菌菌絲提取物中的 MSCs 和 MSC-外泌體誘導免疫活性小鼠的過敏性氣道炎癥，同時強調(diào) MSC-外泌體比 MSCs 具有更好的影響，因此報道了通過轉換 Th2 減輕 Th2/Th17 誘導的過敏性氣道炎癥/Th17 對 Th1 反應的炎癥反應，并減少肺組織中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞介導的過敏性炎癥。

2015 年有研究報道，在慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 動物模型的環(huán)境氧化應激中，MSCs 分泌的外泌體通過線粒體轉移調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能，并通過轉移調(diào)節(jié)性 microRNA 阻斷包括 TLRs 和 NF-κB 在內(nèi)的中樞炎癥通路例如被稱為 TNF 抑制因子的 miR-451 。

總體而言，可以得出結論，MSC-外泌體可能通過重新平衡免疫系統(tǒng)失調(diào)的功能來加速 COVID-19 患者的康復過程。

基于 MSC 的外泌體的組織再生潛力及其在治療 COVID-19 中的意義

在 SARS-CoV-2 感染的晚期，單核細胞和肺泡巨噬細胞的浸潤會破壞肺上皮-內(nèi)皮屏障的完整性、纖維化和肺泡壁增厚，從而導致肺泡-毛細血管氣體交換功能障礙和缺氧。

幾項研究已經(jīng)在體外和動物模型中很好地證明了免疫系統(tǒng)的抑制特性和受 MSC-外泌體損傷的組織在各種肺部疾病中的再生。此外，MSC-外泌體以劑量依賴的方式有效恢復和修復由 ARDS 引起的肺損傷。

MSC-外泌體中高水平的血管生成素-1 mRNA 被稱為抗炎和抗?jié)B透劑，可減少滲透性肺水腫并減少嗜中性粒細胞的浸潤。最近研究中各種肺部疾?。ㄏ?COPD）的動物模型表明，MSCs 通過 PI3K/Akt 通路分泌的外泌體能夠恢復細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白的表達，并降低實質(zhì)膠原蛋白含量。

此外，有報告稱，通過上調(diào)肺泡上皮細胞中的鈉通道和角質(zhì)形成細胞生長因子 (KGF)，施用 MSC 外泌體后肺泡液體清除率 (AFC) 出現(xiàn)跳躍式增長。

臨床前動物模型研究表明，MSC-外泌體還可以降低肺缺氧性高血壓。在 2012 年一研究團隊評估了 MSC-外泌體在缺氧肺動脈高壓 (PAH) 小鼠模型中的細胞保護作用。

他們通過抑制 STAT3 信號通路來防止缺氧激活，并在肺部過度表達 miR-17 超家族和 miR-204，從而報告了逆轉缺氧性肺動脈高壓。一般來說，上調(diào)丙酮酸脫氫酶 (PDH) 和谷氨酸脫氫酶 1 (GLUD1) 等三羧酸 (TCA) 循環(huán)酶的表達以及改善肺細胞的線粒體功能是 MSC-EXO 減少 PAH 并發(fā)癥的機制。

這些結果表明 MSC-外泌體在修復 COVID-19 相關肺損傷方面具有很高的潛力。然而，要獲得更好的結果，還需要深入研究 SARS-CoV-2 感染的機制和血管效應。

MSC 衍生的外泌體的抗病毒活性

MSC-外泌體提到的三個功能包括抗炎特性、免疫調(diào)節(jié)和通過改變宿主細胞功能實現(xiàn)的組織保護特性。MSC-外泌體還具有由內(nèi)源性貨物產(chǎn)生的天然抗病毒活性，包括 mRNA 和 miRNA。

MSC-外泌體誘導的 T 調(diào)節(jié)細胞的免疫調(diào)節(jié)特性可能會增加感染甲型流感病毒 (IAV) 的新生小鼠中 TCD8 細胞的病毒清除率。曾有研究報道了 MSC-外泌體在豬流感病毒模型中的抗病毒活性。

他們表明，這種活性取決于 mRNA 和 miRNA 在源自 MSC 的外泌體中的存在以及它們向肺上皮細胞的轉運。他們還在豬模型中證明了在 MSC 外泌體給藥后通過避免促炎細胞因子和趨化因子的表達來減輕炎癥。

此外，通過 MSC 外泌體誘導 T 調(diào)節(jié)細胞的表達可能會以未知機制增加 TCD8 細胞的病毒清除率。

MSC-外泌體的抗病毒能力可以在工程類型中得到提升，例如用于遞送負載的抗病毒藥物以及通過在其表面上表達抗體和受體作為納米誘餌來生產(chǎn)工程外泌體。在納米誘餌復合物中，外泌體充當細胞模擬物。通過與病毒結合，它們確實阻止了病毒進入宿主細胞的初始化，這是通過標記病毒來完成的，這要歸功于物理連接，從而增加了感染前被免疫細胞清除的機會。例如，ACE2 存在于肺源性外泌體表面，可在感染前有效捕獲病毒顆粒。

對 MSC 衍生的外泌體進行工程改造以在其表面表達 ACE2，以及它們的其他已知特性，可能在對抗 SARS-CoV-2 方面具有更大的潛力，這證實了 Shennawy 等人獲得的結果。這揭示了來自 COVID-19 患者的血漿分離的 ACE2 表達 (ACE2+) 外泌體中和 SARS-CoV-2 感染的能力。

表2總結了 MSC 及其外泌體在肺損傷中的治療益處

表2 MSC及其外泌體在肺損傷治療中的療效比較

注：MSC 間充質(zhì)干細胞、EV 細胞外囊泡、MQ 巨噬細胞、Treg T 調(diào)節(jié)細胞、Teff T 效應細胞、AFC 肺泡液清除率。箭頭代表：增加，↑；減少↓；歸納法，?→?；抑制，T。

MSC 和 MSC 衍生的外泌體：COVID-19 治療效率的比較

關于外泌體或細胞療法哪個效果更好的爭論仍然懸而未決。盡管具有幾乎相同的治療效果，但這兩種策略中的任何一種都有其自身的優(yōu)點和缺點，這些優(yōu)點和缺點會影響治療 COVID-19 患者的可行策略的選擇。

1.外泌體功能與其源細胞的比較表明，外泌體能夠通過不同或相似的機制發(fā)揮相同的作用，并且在許多情況下甚至更有效。例如，研究證實了 MSC 衍生的外泌體比原始細胞具有更好的免疫調(diào)節(jié)功能。因此，在一種可能不同于親本細胞的機制中，MSC 衍生的外泌體改變了 PMSC Treg/Teff 比率，使 CD4 + CD25 + CD127low Tregs 增加，并且還改變了抗炎細胞因子的數(shù)量，包括 IL-10 增加。

2.由于體積小，外泌體能夠穿過細靜脈甚至血腦屏障，而間充質(zhì)干細胞會立即被困在肺部并造成肺栓塞和梗塞，尤其是在靜脈注射后。例如，靜脈注射 inoxine 標記的 MSCs 表現(xiàn)出較高的初始攝取量，并且由于其相對較大的尺寸（懸浮液中≈ 25 μm），大量 MSCs 早期被困在肺中，影響其快速發(fā)揮作用。

3.由于其表面不存在 MHC I-II 類，同種異體和自體 MSC 衍生的外泌體都是安全的。在 2020 年 4 月的一項前瞻性非隨機隊列研究中，研究人員評估了來自同種異體 BMSC 的外泌體在 COVID-19 患者中的安全性和治療效果。單次靜脈注射外泌體 72 小時后，未觀察到不良反應，并且滿足了研究的所有安全終點。接受觀察的 24 名患者中有 17 名 (71%) 康復。在臨床上，患者恢復氧合的能力得到改善。實驗室測試的結果還表明，通過增加中性粒細胞和淋巴細胞計數(shù)來重建免疫力，通過減少急性期反應物、C 反應蛋白和鐵蛋白來抑制細胞因子風暴。除了這一發(fā)現(xiàn)，他們還報告說，MSC 衍生的外泌體是重癥 COVID-19 的一種理想的新型治療選擇。如前所述，MSCs 的異常分化和自發(fā)轉化仍然是一個問題。

4.取消外泌體參考[胚胎干細胞 (ESC) 和誘導多能干細胞 (iPS)] 的譜系等限制，結合根據(jù) GMP 指南生產(chǎn)和冷凍保存臨床級外泌體的開發(fā)技術，使它們的生產(chǎn)更容易，因此成本更低。例如，外泌體生產(chǎn)質(zhì)量控制可以從第一步開始，即供體能力分析，隨后在所有階段實施。此外，一些生產(chǎn)過程，如最終濃縮和小瓶灌裝，可以全自動方式進行，代表了閉環(huán)系統(tǒng)的一個例子。并對每個外泌體批次的最終產(chǎn)品進行大小、同質(zhì)性、數(shù)量以及陽性和陰性標記的分析。

5.外泌體和工程外泌體的簡單操作允許通過各種直接和間接技術生產(chǎn)范圍廣泛的針對預期目的定制的產(chǎn)品。也可以通過加載治療藥物來提高外泌體的治療效果。

6.MSC-外泌體的另一個優(yōu)勢是，母細胞在治療 COVID-19 時允許通過鼻腔給藥載有抗病毒藥物的外泌體，并將它們直接轉移到最常接觸冠狀病毒的鼻粘膜和肺部，從而作為擬議藥物有望有效發(fā)揮作用的目的地。

然而，基于外泌體的療法的發(fā)展仍然存在一些障礙。

第一個挑戰(zhàn)是找到滿足治療目標的合適細胞來源。組織來源、供體年齡和培養(yǎng)條件等各種因素也可能改變治療特性，包括 MSC 的免疫調(diào)節(jié)和分化能力，誘導多能干細胞無限擴增的特點可能是這一解決的重要方向。

第二個問題是外泌體生產(chǎn)對細胞培養(yǎng)的整體依賴性。外泌體由細胞分泌。因此，大量生產(chǎn)它們需要在不損害其生產(chǎn)細胞的基因型和表型特性的情況下生產(chǎn)大量細胞。

在耗時更少且更具成本效益的過程中獲得大量細胞是限制穩(wěn)定產(chǎn)品的又一步。它肯定會限制大量生產(chǎn)攜帶細胞衍生外泌體的干細胞條件培養(yǎng)基。

然而，基于增加表面積技術的細胞培養(yǎng)開發(fā)的成功在很大程度上克服了這種限制。然而，控制表型改變風險和凋亡小體形成等環(huán)境參數(shù)的復雜性會降低最終產(chǎn)品的質(zhì)量和數(shù)量。

由于外泌體是細胞的分泌產(chǎn)物，灌注生物反應器培養(yǎng)細胞，如中空纖維灌注生物反應器，在培養(yǎng)過程中提供了充分的傳質(zhì)，也提供了連續(xù)的高細胞密度培養(yǎng)，有效降低了細胞對血清因子的需求。Integra CELLine 系統(tǒng)是新型燒瓶“生物反應器”，能夠?qū)⑼饷隗w濃縮在膜室內(nèi)，并允許長時間轉移培養(yǎng)基。增加外泌體的濃度有效地減少了下游加工步驟，從而減少了由此產(chǎn)生的成本。

與大規(guī)模細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中外泌體生產(chǎn)相關的另一個限制性問題是最佳細胞生長對動物血清的依賴性。這在兩個方面是有問題的。第一個問題與病毒污染風險增加有關，而第二個問題涉及動物血清中大量存在的外泌體，如果在細胞培養(yǎng)前不去除，可能會進入最終產(chǎn)品并在注射前使其無法接受。另一種建議是無血清和無異種成分的培養(yǎng)基成分，但前提是它保持外泌體產(chǎn)品的可比治療特性。

與貼壁生產(chǎn)細胞（如干細胞）相比，外泌體的一個顯著優(yōu)勢是它們可以簡單地從條件培養(yǎng)基中分離出來。然而，貼壁細胞產(chǎn)物通過酶促分離，這增加了下游加工操作成本和純化時間，同時降低了效率，導致產(chǎn)品損失。

在下游加工中，通常使用四種分離方法來純化外泌體，包括沉降力、親和分離、過濾和聚合沉淀。由于不同的原因，這些方法中的每一種都可能不適用于外泌體的大規(guī)模生產(chǎn)。

例如，超速離心的過程冗長、步驟重復以及分離過程中外泌體的破壞等局限性是微不足道的。然而，對于納米特異性沉淀，它不僅需要下游處理以從最終產(chǎn)品中去除 PEG，而且由于各種類型的 EV 和蛋白質(zhì)的共分離，也會降低最終產(chǎn)品的純度。

通過針對外泌體表面標記物的抗體進行親和純化可能是外泌體純化的最佳方法，與其他方法相比，它可以產(chǎn)生更純、更均一的產(chǎn)品。

所提出的外泌體純化的理想工藝是基于序列的工藝，結合過濾和基于色譜的方法設計。這種策略的一個很好的例子是切向流過濾，它能夠以 125 倍的濃度純化 MSC 外泌體。

另一個挑戰(zhàn)是外泌體亞群的異質(zhì)性。幾乎所有研究都使用外泌體來指代分離的細胞外囊泡。這種歧義部分是由于提取方法無法分離外泌體亞型，以及缺乏對每種類型外泌體的準確描述，因為它們的許多特性在外泌體亞型之間重疊，例如大小和標記。

當觀察到用不同大小的樹突狀細胞分離的外泌體可以誘導不同類別的 T 細胞如細胞毒性 T 細胞、輔助性 T 細胞和調(diào)節(jié)性 T 細胞時，人們認識到了這一問題的重要性。此外，外泌體產(chǎn)品的生物活性物質(zhì)的定量測定仍然是其治療規(guī)模發(fā)展的主要挑戰(zhàn)。

根據(jù) FDA 標準，效力被定義為產(chǎn)品產(chǎn)生預期結果的特定能力或容量。有必要應用一個獨特的效力單位來評估外泌體效力，以標準化實踐并克服批次間產(chǎn)品之間的不一致和差異。值得注意的一點是，體外效力測定必須能夠準確預測體內(nèi)結果，以便它針對每種疾病、適合指定目的并與最終功能相關。例如，為了定義 MSC 外泌體的效力，它們的免疫調(diào)節(jié)特性已被用于在與它們孵育過程后從單核細胞中誘導 IL-10。

基于外泌體的臨床試驗的另一個障礙是分配給它們的促凝血活性。這是外泌體及其起源細胞的生物學特性，因為它們的表面攜帶相同的受體和蛋白質(zhì)，包括磷脂酰絲氨酸，磷脂酰絲氨酸是眾所周知的促進凝血活性的關鍵成分，組織因子是凝血的主要引發(fā)劑。細胞來源、傳代數(shù)和活力是能夠在外泌體給藥后加強血液中凝血級聯(lián)的其他重要因素。

一種防止外泌體促凝活性的建議解決方案是使用抗凝劑（肝素和比伐盧定）的組合進行治療。研究證明單一療法只能通過肝素進行，因為在外泌體的促凝血活性中使用不同的蛋白質(zhì)是無效的。

此外，外泌體分離產(chǎn)生的最終產(chǎn)品的質(zhì)量是最小化外泌體凝血活性的另一個有效因素。尼爾森等人。表明，增加分離外泌體的純度并去除更多污染物，包括血漿蛋白和脂蛋白，可降低癌癥患者血栓形成的風險。許多患有 COVID-19 的住院患者都面臨著更高的凝血病和靜脈血栓栓塞風險，目前需要服用抗凝和纖溶藥物。因此，建議極其謹慎地進行進一步分析，以預防或減少 COVID-19 患者外泌體的可能并發(fā)癥，這些患者面臨血栓形成的高風險。

相比之下，最近的一項研究。證明 MSCs 可以通過平衡止血因子來降低 COVID-19 中血栓形成和凝血的風險。該功能涉及多種機制，(1) MSCs 通過降低促炎細胞因子如 TNF-α、IFN-γ、IL 的表達，減少血管內(nèi)皮細胞的凋亡，進而減少血管損傷和彌散性血管內(nèi)凝血 (DIC) -6。(2) MSCs 對免疫細胞的抑制，包括 T 細胞毒性淋巴細胞、NK 細胞和 B 細胞，可防止微血栓纖維蛋白的形成，并且 (3) MSCs 改變巨噬細胞極化向 M2 表型的分化，從而促進新血管形成和組織修復。

表3總結了 MSC 療法和 MSC 外泌體療法治療 COVID-19 的比較。

表3 MSC-療法和MSC-外泌體療法治療COVID-1的比較總結

這種能力很可能存在于它們分泌的外泌體中，這為 MSC-外泌體治療 COVID-19 患者增加了另一個好處。

總之，創(chuàng)建新的臨床治療策略不僅需要多年的臨床前研究，還需要成功完成三個不同的臨床階段。在過去的十年中，MSC-外泌體的治療潛力及其在臨床前和動物模型中的能力得到了評估，希望能找到治療不治之癥的新方法。COVID-19 危機是評估從 MSC-外泌體治療潛力中獲得的知識的機會。在中國進行的第一項臨床研究結果表明，MSC-外泌體可有效避免 COVID-19 的進展并治愈受損的肺部。此外，安全性、穩(wěn)定性和可擴展性等內(nèi)在特性使外泌體成為 COVID-19 理想且實用的治療選擇。

原文作者Nashmin Fayazi Hosseini等，2022年1月發(fā)表在國際學術期刊Biotechnology Letters 上，原標題Stem cells or their exosomes: which is preferred in COVID-19 treatment?本文為節(jié)選編輯。

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MSCs-Exo系列四 | 間充質(zhì)干細胞外泌體在肝損傷中的應用（點擊鏈接）

MSCs-Exo系列五 | 間充質(zhì)干細胞外泌體在腎損傷中的應用（點擊鏈接）

MSCs-Exo系列六 | 間充質(zhì)干細胞外泌體在腦卒中中的應用（點擊鏈接）

MSCs-Exo系列七 | 間充質(zhì)干細胞外泌體在糖尿病中的應用（點擊鏈接）

NK細胞在腫瘤免疫治療中的應用系列：

免疫治療系列一 | NK細胞在白血病治療中的應用（點擊鏈接）

免疫治療系列二 | NK細胞在肝癌治療中的應用（點擊鏈接）