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小靈子，我，即將畢業(yè)的醫(yī)學(xué)研三狗，分享一下從師姐以及大神那里學(xué)來(lái)的提質(zhì)粒方法，第一次做，算比較成功，雖然其中過(guò)程非常曲折。中間問(wèn)了身邊好多同學(xué)，都不是很會(huì)，研一上課的時(shí)候?qū)W實(shí)驗(yàn)，老師也只是簡(jiǎn)單講了一下提純的步驟，所以我這個(gè)科研小白還是打算來(lái)和大家分享一下，希望對(duì)有需要的同學(xué)有所幫助，也希望大家能夠多多交流，萬(wàn)一有大神指點(diǎn)呢！ Day1 第一天最重要的是什么！當(dāng)然是準(zhǔn)備工作！ 準(zhǔn)備工作 1. 配液體 LB（這個(gè)東西我們這么叫，但是同科室專門做菌的小姐姐管它叫腦心脊液，也是我比較困惑的一點(diǎn)）蛋白胨 10g， 酵母 7.5g， NaCl15g，去離子水定容到 1000ml —— actually，用不了那么多，兩個(gè)樣最多用 300ml，剩下的近期沒(méi)有其他人用，扔掉我們還很心痛，所以暫時(shí)還放在我們 4℃ 冰箱里保存著嗚嗚嗚——所以，如果沒(méi)有那么多樣品的話，建議可以按比例減掉的喲！ 2. 配 CaCl 2 ：4.44g CaCl 2 + 500ml 去離子水 （當(dāng)然一次就用一點(diǎn)點(diǎn)，也可以按比例遞減的）不過(guò)沒(méi)用完，沒(méi)結(jié)晶的話以后也可以用。 3. 配固體培養(yǎng)基：蛋白胨 1g ， 酵母 0.5g， NaCl 1g ， 瓊脂1g，去離子水定容到 100ml。 4. 玻璃珠（這個(gè)是涂我們的小菌菌用的，我覺(jué)得用接種環(huán)、干凈的棉簽、小木棍都可以，實(shí)驗(yàn)室有啥用啥，能省就省?。?/span> 5. 一套槍頭（作為科研狗就別問(wèn)我一套槍頭是什么意思了！） 6. 玻璃培養(yǎng)皿 (講道理，塑料的10cm皿也可以)。 7. 離心管（ 15ml 的多來(lái)點(diǎn)?。?/span> 8. 一盒Ep管（ 1.5ml 的就夠了） 9. 配抗生素： Ampicillin ：工作液 100μg/ml ,可以先配成 100μg/μl ,用時(shí) 1:1000 Kanamycin ：工作液 25μg/ml ,可以先配成 25μg/μl ,用時(shí) 1:1000（不一定每個(gè)質(zhì)粒都一樣哦，記得看它帶來(lái)的說(shuō)明書?。。。?/span> PS：固體培養(yǎng)基先不要高壓，涼了就凝了！其他的速度高壓，烘干放在超凈臺(tái)里等待我們接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)hiahia~ 步驟一：搖菌 將大腸桿菌（一點(diǎn)就夠~具體我反正是加了 10μl ）3~4ml LB 培養(yǎng)基中， 37℃ 過(guò)夜，劇烈搖晃~ 150-200r 就可以啦。SHAKE! JUST SHAKE! LET’S SHAKE!（我用的是大腸桿菌，其他菌種，作為一個(gè)菜鳥(niǎo)我也不是很清楚了！如果實(shí)在不知道就去多問(wèn)一問(wèn)吧、自己查去！哈哈哈哈哈） Day2:又是新的一天！ 步驟一：菌種活化 把我們昨天搖的菌拿出來(lái)，觀察一下下它活沒(méi)活——如果活了它會(huì)又臭又渾濁的~但是會(huì)很開(kāi)心~小菌菌它活了~ 菌：LB=1:1000 （大神表示其實(shí) 1:100~1:300 比較好，能活化的快一點(diǎn)） 37℃，110r 劇烈搖， 1~1.5 小時(shí) （可能 3h更好一些） 目的：讓菌液的 OD 值在 0.3~0.6 之間，處于對(duì)數(shù)期。 步驟二：高壓滅菌 高壓滅菌，請(qǐng)根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室的情況在活化菌種的三個(gè)小時(shí)里，高壓固體培養(yǎng)基。 高壓完的固體 LB 冷卻到手溫—這個(gè)溫度需要自己掌握，我第一次做的時(shí)候就翻車了，因?yàn)槔鋮s到手溫再加抗生素再倒就已經(jīng)來(lái)不及了，前幾個(gè)皿還算可以，剩下的直接給我凝在了錐形瓶里，所以第二次老師弟幫我問(wèn)了度娘，說(shuō)手心不燙手背燙的溫度就可以了（當(dāng)然這個(gè)有點(diǎn)迷幻我沒(méi)做到） 后來(lái)我又問(wèn)了實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)菌的美麗小姐姐，她表示 50~60℃ 就可以，她加很多種抗生素，那些抗生素該好用還是會(huì)好用的，于是我做的時(shí)候就放心大膽地只要 溫度降到在我手可以忍受的程度了，就開(kāi)始加抗生素然后倒平皿！ 所以真正的實(shí)驗(yàn)步驟開(kāi)始了：以下步驟請(qǐng)?jiān)诔瑑襞_(tái)中完成。 高壓后的固體培養(yǎng)基冷卻到實(shí)驗(yàn)者自己可以忍受的溫度，按質(zhì)粒說(shuō)明書上所帶的抗生素濃度加入抗生素，倒入平皿中，打開(kāi)排風(fēng)扇，打開(kāi)平皿蓋等凝固，凝固后蓋上平皿蓋，倒置平皿。 PS：磨嘰的我又來(lái)了！倒平皿的時(shí)候請(qǐng)把皿拿起來(lái)半蓋蓋子胳膊肘放在臺(tái)子上，皿舉在你的眼睛前面，這樣能保證你的手不會(huì)污染皿，也能保證你能看到倒了多少培養(yǎng)基進(jìn)去。像這樣：
培養(yǎng)基的量就是不能太薄到一挑就破了，也不能太多，要不其他皿該不夠了。 然后培養(yǎng)基倒完了不能有氣泡，要平整—老師弟在我耳邊這樣念叨。 步驟三 取出搖好活化的菌，取 1~1.5ml 加入 Ep 管中， 4℃ ， 1000r ， 1min（這個(gè)我覺(jué)得取決于你要提幾個(gè)質(zhì)粒，樣品多的話取兩管 1.5ml 的）。 步驟四 用槍頭吸出培養(yǎng)基，加入 200μl 預(yù)冷過(guò)的 4℃ CaCl2 ， 吹打混勻，分裝 5 0μl 一管，制備感受態(tài)。 步驟五 把分裝出的 EP 管在冰上靜置 20min ，加入質(zhì)粒 50~100ng （我覺(jué)得如果質(zhì)粒濃度本身就高可以多加一點(diǎn)，畢竟少于1μl量太小不好掌握，別浪費(fèi)就行），再冰上靜置 20min ， 熱激42℃，90s （務(wù)必精準(zhǔn)迅速！），插回冰上，靜置 10min 。 熱激是為了打開(kāi)孔道，讓質(zhì)粒進(jìn)入，插回冰上是為了關(guān)閉孔道，讓質(zhì)粒出不來(lái)~hiahia~（這一步是很重要的一步，隱藏著很多細(xì)節(jié)，比如你什么時(shí)候制冰，什么時(shí)候開(kāi)恒溫水浴箱，原始的質(zhì)粒什么時(shí)候找出來(lái)，我就提醒到這里啦，根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)室情況看著辦吧）。 步驟六 加入無(wú)抗生素 LB 每管 500μl ， 37℃ 慢搖（ 80r ）， ????????????????????????????????1h。 目的：轉(zhuǎn)進(jìn)去質(zhì)粒的細(xì)菌表達(dá)出抗性蛋白，使細(xì)菌耐對(duì)應(yīng)的抗生素。 步驟七 涂板，這時(shí)候就是要用到玻璃珠或者接種環(huán)balabala的，加入適量菌液（我怕菌不算太多，加了 80μl ，一般 50μl 就夠，太多了菌落容易瘋長(zhǎng)不好挑菌），玻璃珠就輕輕來(lái)回?fù)u就可以了，你能看到培養(yǎng)基上菌液劃過(guò)的痕跡。接種環(huán)或者別的就自己想吧，反正涂開(kāi)就行。 Like this ~
步驟八 倒置平板， 37℃ 孵箱過(guò)夜。 PS：今天的實(shí)驗(yàn)要設(shè)置好對(duì)照，需要有加抗生素培養(yǎng)基的空白對(duì)照，加了菌種的陰性對(duì)照，和你的樣品。如果明天一看空白對(duì)照和陰性對(duì)照長(zhǎng)了菌，恭喜你不用繼續(xù)往下做了，要不就是污染了，要不就是抗生素不好使。如果明天你的樣品沒(méi)長(zhǎng)出來(lái)菌，恭喜你也做不下去了，要不就是抗生素加多了，要不就是質(zhì)粒沒(méi)進(jìn)去哈哈哈哈！(以上代表個(gè)人觀點(diǎn)，如有不對(duì)請(qǐng)告訴我！) Day3:又是新的一天！ 步驟一 取出平皿，觀察菌落是否生長(zhǎng)， 4℃ 倒置放（先保存一會(huì)， 37℃ 時(shí)間久了菌落會(huì)太多） 步驟二 將抗生素按說(shuō)明書濃度加入 LB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基 3~4ml ，挑出菌落，連槍頭一起打入（注意是單個(gè)菌落，我問(wèn)了一個(gè)可愛(ài)的老師什么叫單個(gè)菌落，我們一致認(rèn)為就是長(zhǎng)得小的哈哈哈） 為了以防萬(wàn)一，第一次做這個(gè)實(shí)驗(yàn)的我選擇挑了兩個(gè)看著順眼的小菌落~ 步驟三 37℃ ，劇烈搖 150r 過(guò)夜。 PS：挑菌的時(shí)候用槍頭，盡量不要扎破培養(yǎng)基，并且挑一半留一半，我覺(jué)得輕輕刮下來(lái)就好，畢竟只是為了把小菌菌挑出來(lái)繼續(xù)長(zhǎng)。這步時(shí)間很少，找空隙做就好，晚上離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室之前給它搖上就行，因?yàn)榫鷵u的時(shí)間不宜太長(zhǎng)， 15~17h 比較好，太久的話菌會(huì)老化也會(huì)變得太多。 前面忘記說(shuō)了，因?yàn)榇竽c桿菌的特性，這種離心管搖的時(shí)候要擰松但是拔不下來(lái)。然后搖的時(shí)候離心管斜著插，保證能搖起來(lái)。 大概圖中介個(gè)亞子：
Day4：又又又是新的一天！ 今天我們就要用到 21 世紀(jì)科研工作者的福音：試劑盒，今天需要先小提一下先驗(yàn)證一下擴(kuò)增的質(zhì)粒是否和原質(zhì)粒一致，第二天再進(jìn)行質(zhì)粒大提。 質(zhì)粒小提不要把菌液都用了，否則大提就沒(méi)有菌啦！4ml我就用 1.5ml ，一個(gè) EP 管的量就可以啦。 步驟一： 質(zhì)粒小提 質(zhì)粒小提：下面附上說(shuō)明書（我和老師弟一致認(rèn)為這玩意太好用了）。 PS:小提的時(shí)候就不用在超凈臺(tái)里面啦!只要按照說(shuō)明書操作就可以啦，注意試劑順序不要加反什么的。離心時(shí)間和加入液體的體積按自己菌液的情況加入，我，身為一個(gè)天秤，在保證實(shí)驗(yàn)?zāi)苓M(jìn)行下去的情況下都取了比較中間的值~
質(zhì)粒小提的這個(gè)試劑盒不是去內(nèi)毒素的，價(jià)格很便宜，畢竟只是為了初步驗(yàn)證質(zhì)粒質(zhì)量，如何驗(yàn)證呢？蛋白用 WB ，核酸當(dāng)然用瓊脂糖 ~ 步驟二： 瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳：自己好好查一下配 LB 培養(yǎng)基的瓊脂和瓊脂糖！試劑上多數(shù)都是英語(yǔ)，用翻譯軟件的時(shí)候一定要看清楚不要弄反了，瓊脂糖好貴的呢！ a)制備瓊脂糖凝膠：
b)點(diǎn)樣：上樣前預(yù)電泳3~5 min 。核酸樣品與上樣緩沖液混合后，點(diǎn)樣，先加入 Marker 。6×loading的話就可以：1μlloading ， 3μl去離子水， 2μl核酸樣品（感覺(jué)這個(gè)實(shí)驗(yàn)整個(gè)就很隨意，根據(jù)自己條件調(diào)節(jié)吧）。 c)電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓 60-100V，樣品由負(fù)極（黑色）向正極（紅色）方向移動(dòng)。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約 1cm處時(shí)，停止電泳。 d)電泳后的凝膠照相：將染色后的凝膠置于紫外燈下進(jìn)行照相。攝影用的紫外模式。選擇合適曝光時(shí)間，一般為5 秒左右。 大致分子量位置相同則你的質(zhì)粒就是成功的啦，拿 Day3 所得菌液剩下的繼續(xù)搖菌，等著明天大提就可以啦~ 這里要說(shuō)一下我又問(wèn)的傻乎乎的問(wèn)題，大提我就是用小提 剩下的菌+100ml 加抗生素 LB ， 150r 劇烈搖，過(guò)夜 。為了空間夠我用的是錐形瓶，然后把蓋子弄松以后打開(kāi)機(jī)器開(kāi)始 shake，蓋子，居然，飛了出去！還好我眼疾手快扶住了！急忙問(wèn)了大神，大神表示，你們那個(gè)錐形瓶蓋子是透氣的吧。 我……感覺(jué)自己是個(gè) simpleton！神奇的透氣蓋子如圖
Day5：質(zhì)粒大提
以上就是我做質(zhì)粒擴(kuò)增及提純的全部經(jīng)驗(yàn)啦，啰啰嗦嗦說(shuō)了一大堆，在這里感謝，在這一個(gè)簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)期間為我提供各種支持的老師們和小伙伴們~
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來(lái)自： Amazing427 > 《質(zhì)粒構(gòu)建》
