【原】環(huán)境微生物測序采樣指南

凌恩生物 2022-06-17 發(fā)布于陜西

展開全文

隨著高通量測序技術(shù)飛速發(fā)展，人們對微生物的認知也在逐漸深入。凌恩生物每天都會接到全國各類型微生物測序樣本，上到山巔土壤，下至深海底泥；有老師研究植物根際和葉內(nèi)微生物，也有老師關(guān)注動物昆蟲腸道生理代謝的奧秘。為了得到能夠研究的測序結(jié)果，規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的取樣及送樣是成功的前提。

在樣本送測前，我們要注意以下幾點：

取樣使用的工具及容器必須經(jīng)過滅菌處理；
取樣后及時做好標(biāo)記，記錄取樣相關(guān)信息；
樣本送測前做好備份，防止意外發(fā)生丟失珍貴樣本；
送測樣本使用標(biāo)準(zhǔn)容器承裝，在容器上標(biāo)記清晰，送樣不宜過多；
寄送時保持低溫環(huán)境，建議使用干冰配送；
可使用凌恩微生態(tài)樣本保真液，高品質(zhì)樣本是決定高品質(zhì)研究成果的第一步。

常規(guī)土壤類樣本取樣方法-農(nóng)田/森林/草原土壤等

(1) 取樣方法

按實驗設(shè)計確定采樣范圍，取樣器具需事先消毒滅菌處理。采樣時應(yīng)去除地表雜質(zhì)，根據(jù)需要挖取相應(yīng)深度（如5~20 cm）的土壤，置于冰上運至實驗室。去除可見雜質(zhì)，建議過2 mm無菌篩網(wǎng)。同一樣方多點樣本等量混合均勻后取5~10 g，保存無菌EP管中，進行核酸提取，或-80℃保存?zhèn)溆?。若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司?/section>

注：建議戴一次性手套、口罩，進行嚴(yán)格取樣和操作，盡可能減少人為的污染。

根際土壤樣本取樣方法-作物/蔬菜/草木根系等

（1）作物類（含草地等矮小植物）根際土壤取樣方法
a. 采集植物植株，去除根部大塊土壤，置于冰上運輸至實驗室；
b. 晃動根部，去除根部松散的土壤后，使用無菌刷子從根部收集殘留土壤；

c. 同一樣方多點取樣土壤樣本等量混合均勻后，液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。

（2）林木類根際土壤取樣方法
a. 采集地面下 10-20 cm 根際土壤，置于冰上運輸至實驗室；
b. 過 2-5 mm 孔徑無菌篩網(wǎng)；
c. 同一樣方多點取樣土壤樣本等量混合均勻后，液氮速凍，置于-80℃冰箱保存。
若不能自行提取，可置于干冰寄送至公司提取。
注：取樣器具請事先消毒滅菌處理。若為真菌根際土壤，請務(wù)必盡可能去除菌絲體殘留，減少對 DNA/RNA 提取的干擾。

植物表面微生物取樣方法?

（1）取樣方法

依據(jù)實驗設(shè)計，進行樣方設(shè)置，每一樣方進行多點取樣，同一樣方點等量混勻成一個樣本。植物根部組織可以通過搖晃振蕩或無菌刷子去除根表粘附土壤。

（2）樣本前處理

將植物組織浸沒于無菌PBS溶液，180rpm孵育20min；取出植物組織，再次加入無菌PBS溶液，180rpm孵育20min，取出植物組織，再次加入無菌PBS溶液，超聲波洗滌10min（參數(shù)：160 W，30s/30s），最后取出植物組織至于-80度冰箱保存?zhèn)溆谩?/section>

將三次洗滌液匯總，過0.2um濾膜（或12000g離心10min，收集沉淀），收集濾膜至于-80度冰箱保存。

植物內(nèi)部微生物取樣方法

（1）依據(jù)實驗設(shè)計，進行樣方設(shè)置，每一樣方進行多點取樣，同一樣方點等量混勻成一個樣本。

（2）對植物組織進行表面消毒操作或者使用上一步“ 植物表面微生物取樣”中處理過的植物組織，液氮速凍后，研磨成粉，即可用來進行核酸的提取。

植物組織表面消毒具體操作如下：

無菌水洗滌30s，70%無菌乙醇洗滌2min，2,5% NaClO（含0.1% Tween 80）浸泡5min后轉(zhuǎn)移至70%無菌乙醇浸泡30s，最后使用無菌水洗滌植物組織3次，即視為對植物組織表面進行無菌化。

表面無菌化的植物組織至于-80度冰箱保存?zhèn)溆没蜻M行核酸提取。

植物根表面微生物取樣方法

（1）將所研究的物體放在事先滅好的無菌容器當(dāng)中；

（2）加入PBS緩沖液后進行振蕩，使得微生物從物體表面充分的脫落并聚集在PBS緩沖液當(dāng)中,震蕩至少2h以上；

（3）直接提取PBS緩沖液中的微生物或者將緩沖液用濾膜過濾之后再進行DNA的提取。

PBS濃度和PH有要求：濃度是用1x的，PH值是7.4，一般買回來的PBS是10x的，建議稀釋到1x。