一、了解NOTCH3基因突變類(lèi)型與熱點(diǎn)，判斷突變的致病性

在HGMD（The Human Gene Mutation Database）專業(yè)版數(shù)據(jù)庫(kù)中目前CADASIL患者NOTCH3基因突變超過(guò)300種。絕大多數(shù)以錯(cuò)義突變?yōu)橹鳎s95%），也有剪接突變、小的插入刪除、無(wú)義突變等類(lèi)型。絕大多數(shù)突變（約98%）位于編碼34個(gè)EGFR的NOTCH3胞外域的2~23號(hào)外顯子內(nèi)，并且涉及典型的與CADASIL相關(guān)的半胱氨酸殘基改變^［5］。

國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)CADASIL患者中NOTCH3基因的突變主要集中在第3、4、5、6、8、11、18外顯子。然而不同人群NOTCH3基因突變熱點(diǎn)外顯子區(qū)域是存在差異的。其中白種人中NOTCH3基因第4外顯子突變率最高，其次位于第3和第11外顯子，而在亞洲國(guó)家和地區(qū)，比如日本的研究結(jié)果顯示突變最常見(jiàn)的區(qū)域是4號(hào)外顯子，其次是3、6、8號(hào)外顯子^［9］。至于我國(guó)CADASIL患者NOTCH3基因突變情況，文周等^［10］報(bào)道2009—2016年中國(guó)金域檢測(cè)中心檢測(cè)出275例NOTCH3基因突變陽(yáng)性CADASIL患者，最常見(jiàn)的突變區(qū)域是第4以及11號(hào)外顯子。局部地區(qū)比如我國(guó)北部以3、4號(hào)外顯子多見(jiàn)，東部地區(qū)則為4、11號(hào)外顯子^［11］。Chen等^［12］通過(guò)分析我國(guó)大陸東南部情況結(jié)果也顯示第11號(hào)外顯子突變最為常見(jiàn)（41.07%），其次為第4以及第3號(hào)外顯子，分別占33.33%和13.69%。我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)則與大陸東南部的研究結(jié)果相似，也是第11號(hào)外顯子為最常見(jiàn)的突變區(qū)域，其次是第4號(hào)外顯子^［13］。我們實(shí)驗(yàn)室2017年總結(jié)了河南地區(qū)19個(gè)家系37例患者資料發(fā)現(xiàn)NOTCH3基因突變的熱點(diǎn)集中在11以及4號(hào)外顯子^［14］。

另外，NOTCH3基因突變熱點(diǎn)位點(diǎn)也具有明顯的地區(qū)和族群差異。比如：意大利中南部地區(qū)最常見(jiàn)的突變是第11號(hào)外顯子的R607C（21%），芬蘭為第3號(hào)外顯子的R133C（87.5%）^{［15, 16］}。東亞地區(qū)較為相似，韓國(guó)濟(jì)州島^［17］最常見(jiàn)的突變是第11號(hào)外顯子的R544C，而我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)R544C位點(diǎn)占比高達(dá)70.5%^［13］。文周等^［10］的研究結(jié)果顯示R544C位點(diǎn)也是我國(guó)大陸地區(qū)最為常見(jiàn)的位點(diǎn)，達(dá)到23.27%。Chen等^［12］的研究主要集中在我國(guó)大陸東南部，最主要的突變位點(diǎn)是第11號(hào)外顯子的R607C（19.05%）、R544C（15.48%）以及第3號(hào)外顯子的Arg90Cys（8.93%），其中R607C主要集中在江蘇、上海和浙江，而R544C集中在福建與臺(tái)灣。東亞地區(qū)比較特別的是日本，最為常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是R133C（23%）、R75P（13%）以及R182C（13%）^［9］。

雖然CADASIL患者中NOTCH3基因突變主要是導(dǎo)致半胱氨酸數(shù)量改變的突變（文中簡(jiǎn)稱半胱氨酸突變），然而隨著測(cè)序的普遍，也有不少考慮為CADASIL的患者檢測(cè)出NOTCH3基因不涉及半胱氨酸的改變（文中簡(jiǎn)稱非半胱氨酸突變）。目前，這些突變的致病性是存在爭(zhēng)議的，有的學(xué)者認(rèn)為屬于基因多態(tài)性，而非致病性突變。這種情況在歐美發(fā)生概率極低，在日本、韓國(guó)等人群中較多，中國(guó)也有案例報(bào)道，其臨床意義仍有待進(jìn)一步探索。據(jù)此Mui?o等^［18］提出了1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)可以參考，即若符合以下5點(diǎn)，則該突變有致病意義：（1）CADASIL典型的臨床表現(xiàn)；（2）MRI顯示彌漫性腦白質(zhì)損傷；（3）NOTCH3基因全外顯子檢測(cè)且排除了半胱氨酸突變；（4）突變?yōu)榉嵌鄳B(tài)性；（5）活檢發(fā)現(xiàn)嗜鋨顆粒沉積。根據(jù)這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，我們實(shí)驗(yàn)室^［19］報(bào)道了5例CADASIL患者攜帶非半胱氨酸突變，分別為R75Q、D80G、V237M、S1418L以及R1761L。同時(shí)分析了非半胱氨酸突變患者的臨床和影像學(xué)特征，與經(jīng)典型CADASIL相比非常相似并無(wú)明顯區(qū)別。雖然總結(jié)的病例較少，但這是國(guó)內(nèi)系統(tǒng)分析非半胱氨酸突變潛在致病性以及臨床特征的首次報(bào)道，大大提高了對(duì)疾病的認(rèn)知程度，也為我們探尋CADASIL的致病機(jī)制提供了新的線索。

隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，測(cè)序技術(shù)不斷迭代，測(cè)序成本呈超摩爾定律的急劇下降，使得人類(lèi)積累的基因變異數(shù)據(jù)越來(lái)越多。如何解讀這些海量的數(shù)據(jù)是后基因組時(shí)代的挑戰(zhàn)，對(duì)于NOTCH3基因也不例外。目前絕大多數(shù)還是在病例中發(fā)現(xiàn)變異，可以根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(huì)（The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判斷基因變異是否具有致病性，有條件的還可以進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞功能以及動(dòng)物模型研究。ACMG撰寫(xiě)了英文版的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)^［20］，我國(guó)賀林院士牽頭組織專家也進(jìn)行了中文版的編寫(xiě)^［21］。遺傳變異可分為致病的、可能致病的、良性的、可能良性的、意義不明的5個(gè)等級(jí)。在這個(gè)基礎(chǔ)之上，具體到疑似CADASIL患者NOTCH3基因變異的判斷，一般說(shuō)來(lái)EGFR區(qū)域內(nèi)的涉及半胱氨酸的突變致病性爭(zhēng)議不大，而那些非半胱氨酸突變，或是非EGFR區(qū)域內(nèi)的突變，一定要結(jié)合臨床、影像、病理等方面信息，特別是皮膚活檢GOM沉積或是NOTCH3胞外域免疫組化，做到具體問(wèn)題具體分析。

二、總結(jié)不同基因型臨床及影像特征，揭示基因型與表型之間關(guān)聯(lián)

遺傳學(xué)一直致力于探尋基因型與表型之間的關(guān)系，希望根據(jù)不同基因型對(duì)疾病表型進(jìn)行一些預(yù)測(cè)與判斷，從而輔助臨床診斷或是判斷預(yù)后。攜帶NOTCH3基因EGFR重復(fù)區(qū)域內(nèi)涉及半胱氨酸突變的患者通常表現(xiàn)出比較典型的CADASIL癥狀，比如最常見(jiàn)的臨床癥狀為偏頭痛（尤其是白種人，亞洲人少見(jiàn)）、反復(fù)腦卒中發(fā)作、認(rèn)知障礙、情感障礙。影像學(xué)以白質(zhì)高信號(hào)（尤其是顳極和外囊）、腔隙性梗死為主，伴或不伴微出血及血管周?chē)g隙。

由于奠基者效應(yīng)的存在，在某些地區(qū)某一種特定突變型患者比較多，學(xué)者們就有可能對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)系統(tǒng)的研究。比如研究比較多的R544C突變。Lee等^［17］研究了韓國(guó)濟(jì)州島73例攜帶NOTCH3基因R544C突變的CADASIL患者，發(fā)現(xiàn)受試者的平均年齡為62.2歲（34~86歲）。腦梗死是最常見(jiàn)的表現(xiàn)（37%），其次是認(rèn)知障礙（32%）、頭痛（17%）、精神癥狀（16%）、腦出血（12%）、短暫性腦缺血發(fā)作（7%）和癲癇發(fā)作（1%）。并且與典型的CADASIL相比，發(fā)病年齡較晚，缺血性或出血性發(fā)作患者的年齡為（64.9±10.9）歲（范圍41~86歲）。我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)CADASIL患者中NOTCH3基因R544C突變與前顳葉受累頻率較低、發(fā)病年齡較晚和認(rèn)知功能障礙頻率較高有關(guān)^［13］。在另一項(xiàng)我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的研究^［22］中，發(fā)現(xiàn)NOTCH3基因R544C也是小血管梗塞性（small vessel occlusion，SVO）腦卒中重要的風(fēng)險(xiǎn)因素。在調(diào)整血管危險(xiǎn)因素后，攜帶p.R544C變異體導(dǎo)致腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)增加了3.40倍，SVO腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)增加了11.05倍（P值分別是0.000 1和3.9×10^-10）。

至于非半胱氨酸突變的表型，也有學(xué)者進(jìn)行了探索。Xiromerisiou等^［23］對(duì)發(fā)表的NOTCH3基因突變進(jìn)行了廣泛的文獻(xiàn)研究，并對(duì)所有已發(fā)表的NOTCH3突變病例進(jìn)行了系統(tǒng)的回顧。他們發(fā)現(xiàn)半胱氨酸和非半胱氨酸突變患者的臨床表現(xiàn)和表型嚴(yán)重程度沒(méi)有顯著差異。然而，半胱氨酸與非半胱氨酸突變患者相比，發(fā)病年齡顯著更早（平均差異7.8歲，95%CI 2.2~13.5，P=0.009），分別為43歲和51歲。韓國(guó)的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示：兩者臨床特征與體征差異無(wú)顯著性，非半胱氨酸突變患者在前顳葉腦白質(zhì)改變的頻率低于半胱氨酸突變患者，而其他部位腦白質(zhì)以及腦微出血的頻率和程度兩者之間是相似的，也就是說(shuō)經(jīng)典型的半胱氨酸突變腦白質(zhì)改變更易出現(xiàn)在前顳葉^［24］。

除了突變類(lèi)型以外，突變的位置也會(huì)影響表型。不同外顯子區(qū)域患者發(fā)病年齡存在差異，Chen等^［12］發(fā)現(xiàn)攜帶第11號(hào)外顯子突變的患者發(fā)病年齡一般在50歲左右，較其他外顯子突變患者晚。至于CADASIL首發(fā)臨床癥狀與NOTCH3基因不同外顯子突變之間的關(guān)聯(lián)，翟宇和蘇敬敬^［11］的研究結(jié)果提示NOTCH3基因第4號(hào)外顯子突變的患者以運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言障礙起病占多數(shù)，而第19號(hào)、20號(hào)外顯子突變的患者以認(rèn)知障礙起病更多見(jiàn)。Rutten等^［25］研究結(jié)果顯示NOTCH3突變位點(diǎn)位于EGFR 1~6區(qū)域的比突變位點(diǎn)在7~34區(qū)域的患者具有更加嚴(yán)重的臨床表型，腦卒中發(fā)病年齡更早，預(yù)期生存期更短，腦白質(zhì)損傷負(fù)擔(dān)也更嚴(yán)重。目前已有很多軟件可以幫助判斷基因變異是否有害。Xiromerisiou等^［23］根據(jù)CADD（combined annotation-dependent depletion）算法，對(duì)NOTCH3基因不同單核苷酸以及插入刪除變異的危害進(jìn)行致病性評(píng)分，發(fā)現(xiàn)致病性評(píng)分似乎完全受不同外顯子位置的影響（P<0.001），與表型嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。

我們知道CADASIL是常染色體顯性遺傳病，即NOTCH3基因雜合突變即可致病，不過(guò)在實(shí)踐中也有少數(shù)CADASIL患者NOTCH3純合或復(fù)合雜合突變被報(bào)道。在其中一些患者中，表型被發(fā)現(xiàn)更嚴(yán)重，而另一些患者報(bào)告的臨床嚴(yán)重程度類(lèi)似于雜合突變攜帶者。Al-Shaar等^［26］報(bào)道了1個(gè)受累3代的攜帶R1231C突變的CADASIL家系，13例患者中7例為純合子，6例為雜合子，純合子個(gè)體與雜合子個(gè)體相比，早期發(fā)病的臨床和影像表型略顯嚴(yán)重。而He等^［27］報(bào)道的1個(gè)兄弟二人均攜帶R587C純合子的CADASIL家系中，他們表現(xiàn)為缺血性腦卒中、步態(tài)不穩(wěn)、認(rèn)知障礙和精神障礙等，與先前報(bào)道的雜合子相同突變的患者相似。總的來(lái)說(shuō)，迄今為止所描述的純合突變患者具有正常的CADASIL疾病譜中的表型，嚴(yán)重程度的變化不明顯，可能歸因于CADASIL中所見(jiàn)的自然異質(zhì)性。

雖然有學(xué)者認(rèn)為一些突變可能與更溫和或更嚴(yán)重的表型有關(guān)，但到目前為止還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明確的基因型-表型相關(guān)性。總的來(lái)說(shuō)，攜帶EGFR區(qū)域內(nèi)涉及半胱氨酸數(shù)目改變的突變以及位置越靠EGFR前段的突變，CADASIL患者癥狀越典型、臨床癥狀越嚴(yán)重。NOTCH3基因突變純合子個(gè)體臨床表型并不一定比雜合子個(gè)體更嚴(yán)重。由于疾病的嚴(yán)重程度可能在家庭成員之間，甚至在單卵雙胞胎之間有所不同，因此，除NOTCH3基因突變外，其他因素很可能在疾病中發(fā)揮表型修飾作用，比如個(gè)體的遺傳背景、血管危險(xiǎn)因素、生活方式等多種內(nèi)外因素。遺傳因素方面，載脂蛋白E（ApoE）基因是研究最多的風(fēng)險(xiǎn)基因，不過(guò)結(jié)果不盡相同。Gesierich等^［28］發(fā)現(xiàn)ApoE ε2型與CADASIL患者的腦白質(zhì)高信號(hào)（white matter hyperintensities，WMH）的體積有關(guān)，Lee等^［29］發(fā)現(xiàn)ApoE ε4型提高了韓國(guó)CADASIL患者癡呆的風(fēng)險(xiǎn)，而Singhal等^［30］的研究結(jié)果則顯示ApoE ε4型對(duì)于患者的表型是沒(méi)有影響的。另外，Opherk等^［31］結(jié)合從歐洲7個(gè)中心收集的517例CADASIL患者的Affymetrix芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)研究，以確定影響CADASIL患者WMH體積的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多基因評(píng)分與CADASIL受試者的WMH體積有關(guān)，多個(gè)微小效應(yīng)的遺傳變異影響WMH負(fù)擔(dān)，不過(guò)并沒(méi)有單個(gè)核苷酸多態(tài)性達(dá)到全基因組范圍的顯著性差異。在其他非遺傳因素方面，有研究^{［7，30］}結(jié)果表明高血壓、吸煙會(huì)增加CADASIL患者發(fā)生腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)，而高同型半胱氨酸水平與偏頭痛的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。另一篇文獻(xiàn)^［32］報(bào)道家族中CADASIL患者與健康家系成員之間攜帶的所有血管風(fēng)險(xiǎn)因素的頻率是相似的。在患者中，糖尿病與腦卒中發(fā)生年齡較早相關(guān)。因此對(duì)于沒(méi)有有效治療手段的CADASI，控制血管危險(xiǎn)因素還是十分必要的。總之，疾病是遺傳與環(huán)境互相作用的結(jié)果。即使對(duì)于單基因遺傳病，除致病基因本身的突變形式與位置影響疾病的表型以外，其他方面的因素也會(huì)微效地修飾表型。

三、嘗試CADASIL基因治療，破局罕見(jiàn)病研究

CADASIL作為一種單基因遺傳病，目前沒(méi)有有效的治療手段。由于該病特征性的病理改變是NOTCH3胞外域異常沉積，因此有學(xué)者在CADASIL模型鼠上探索NOTCH3胞外域單克隆抗體5E1的治療潛力。結(jié)果顯示長(zhǎng)期使用5E1不能減弱NOTCH3胞外域或GOM的沉積，也未能停止白質(zhì)損害的發(fā)展，但對(duì)神經(jīng)活動(dòng)和局部應(yīng)用血管擴(kuò)張劑引起的受損腦血流反應(yīng)以及腦動(dòng)脈正常的肌源性反應(yīng)有明顯的保護(hù)作用^［33］。另一方面，基因治療也是這一類(lèi)單基因遺傳病治療的一個(gè)重要研究方向，有學(xué)者也開(kāi)始了這方面的嘗試。2016年Rutten等^［34］通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)包含致病性CADASIL突變熱點(diǎn)區(qū)域的外顯子4、5設(shè)計(jì)反義寡核苷酸，轉(zhuǎn)染CADASIL患者來(lái)源的腦血管平滑肌細(xì)胞，成功地實(shí)現(xiàn)了外顯子跳躍而不會(huì)影響NOTCH3信號(hào)傳導(dǎo)。外顯子4和5包含EGFR2的部分，EGFR3、4、5全部，以及部分EGFR6，經(jīng)過(guò)反義寡核苷酸介導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)EGFR3/4/5的跳躍，使得2與6融合到一起。氨基酸第153位額外增加的無(wú)法配對(duì)的半胱氨酸可以與EGFR6中的半胱氨酸配對(duì)，從而形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。2020年該團(tuán)隊(duì)另一項(xiàng)研究^［35］發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)存在自然發(fā)生的可導(dǎo)致NOTCH3基因外顯子跳躍的特殊現(xiàn)象。報(bào)道的CADASIL患者攜帶半胱氨酸突變（G498C），雖然理論上攜帶EGFR區(qū)域內(nèi)半胱氨酸突變的患者表型應(yīng)該比較典型，但家系成員癥狀溫和，只有WMH，而且60歲以上的患者也沒(méi)有出現(xiàn)認(rèn)知損害。研究發(fā)現(xiàn)突變位于第9號(hào)外顯子的邊界，影響了RNA的剪接從而造成整個(gè)第9號(hào)外顯子的缺失。這也側(cè)面印證了CADASIL患者“半胱氨酸糾正”可能降低NOTCH3蛋白聚集從而減輕癥狀，為治療提供潛在的可行性。

雖然這些研究只是CADASIL基因治療方面初步的嘗試，但意義重大深遠(yuǎn)，為這種罕見(jiàn)病的治療開(kāi)啟了新的研究方向，希望在不久的未來(lái)會(huì)有突破性的進(jìn)展。