STING信號通路不僅可以識別外源病原菌感染的DNA，而且可以識別自身細胞質(zhì)中的DNA，誘發(fā)各種自身炎癥性疾病。通路異?；罨cAicardi-Goutières綜合征（AGS）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、嬰兒期起病的干擾素基因刺激蛋白相關(guān)血管病變（STING-associated vasculopathy with onset in infancy，SAVI）等自身性免疫疾病的發(fā)生密切相關(guān)。
STING通路被激活后，由臨近細胞產(chǎn)生更多的干擾素和相關(guān)細胞因子，產(chǎn)生放大信號的作用。隨后，被招募的樹突狀細胞可以產(chǎn)生CD8+陽性的T細胞和其他炎性相關(guān)的細胞因子，促進淋巴結(jié)中針對腫瘤的特異性T細胞的交叉啟動，產(chǎn)生免疫反應(yīng)并殺死腫瘤細胞。STING可以作為腫瘤治療中的藥物靶點，被一系列的STING激動劑激活，包括：環(huán)狀二核苷酸衍生物（CDNs），小分子藥物，有機聚合物及金屬離子。此外，STING激動劑在腫瘤的聯(lián)合治療中能夠顯著地增強抗腫瘤治療的效果。
 

圖1：STING通路解析

2022年4月11日，劉海鵬/陳昶/費義艷教授合作在EMBO Rports上發(fā)表題為CDK inhibitor Palbociclib targets STING to alleviate autoinflammation的研究成果。
 

圖2：EMBO Rports文獻

該研究通過高通量篩選，發(fā)現(xiàn)臨床上使用的周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs）4/6的抑制劑帕博西尼（Palbociclib）是STING的一種新型抑制劑，其可以直接靶向STING Y167，通過阻斷STING二聚化這一獨特機制抑制其活化過程。該研究發(fā)現(xiàn)了抗癌藥物帕博西尼的全新靶點，并為帕博西尼及其類似物快速應(yīng)用于STING驅(qū)動的自身免疫性疾病的臨床治療提供了新型候選藥物，同時為基于帕博西尼進一步優(yōu)化和開發(fā)新型STING抑制劑奠定了基礎(chǔ)。
HTRF技術(shù)提供了基于生化水平初步篩選和細胞水平功能性驗證的方法，深入研究STING通路。

生化水平篩選
基于HTRF技術(shù)的競爭模型檢測原理，使用d2標(biāo)記STING ligand，Tb標(biāo)記6His STING WT的抗體，。加入的化合物與標(biāo)記為d2的STING WT ligand 競爭，從而阻斷FRET。特異性信號與化合物濃度成反比。
 

圖3：STING binding Assay 原理

如下圖所示，針對mouse STING的DMXAA化合物（紫色三角形），不與human STING ligand競爭結(jié)合。STING binding kit表現(xiàn)出高特異性，適合作為高通量篩選。
 

圖4：STING binding Assay特異性結(jié)果

HTRF技術(shù)提供human和mouse STING相關(guān)的生化篩選試劑盒。

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HTRF STING binding Assay

細胞水平磷酸化蛋白和總蛋白檢測
腫瘤來源的DNA激活環(huán)狀cGAS（GMP-AMP）酶。cGAS催化ATP和GTP產(chǎn)生2'3’cGAMP，一種環(huán)狀二核苷酸(CDN)，2'3’cGAMP作為第二信使與STING蛋白結(jié)合。磷酸化的STING招募TBK1后一同招募致IRF3使其磷酸化。進一步促使下游NF-kB的磷酸化。與此同時，觸發(fā)STING蛋白自噬降解過程。
HTRF磷酸化和總蛋白檢測均采用夾心法模型，一對特異性檢測抗體分別標(biāo)記有熒光能量供體和受體。這意味著FRET信號的強度與裂解液中PHOSPHO & TOTAL STING濃度成正比。
 

圖5：PHOSPHO & TOTAL Protein 檢測原理

STING激活是通過大量STING磷酸化水平提高和STING總蛋白自噬降解揭示的，與檢測結(jié)果相一致，而Alpha-tubulin在相同條件下保持穩(wěn)定。
 

圖6：STING PHOSPHO & TOTAL Assay檢測結(jié)果

下游通路中TBK1和IRF3磷酸化蛋白的檢測，分別采取小鼠肝臟巨噬細胞ImKC細胞密度200000 cells/well，用2’3’cGAMP刺激1小時。人上皮細胞MCF7以125000 cells/well的密度，用2’3’cGAMP（75μM）刺激。結(jié)果所示，磷酸化的TBK1逐步上升且總蛋白基本保持一致。IRF3磷酸化蛋白呈現(xiàn)出上升趨勢。
 

圖7：TBK1和IRF3 PHOSPHO & TOTAL Assay檢測結(jié)果

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HTRF STING Pathway PHOSPHO & TOTAL Assay

下游通路IFNβ定量檢測
磷酸化的IRF3導(dǎo)致IFNβ的分泌，磷酸化NF-kB導(dǎo)致其依賴的炎癥因子的分泌，如TNFα, IL6, IL1β。最后，我們使用HTRF技術(shù)定量IFNβ的分泌，顯示了cGAMP誘導(dǎo)的刺激活時的劑量依賴性的IFNβ分泌結(jié)果。
HTRF IFNβ檢測依然采用夾心法模型，一對特異性檢測抗體分別標(biāo)記有熒光能量供體和受體。這意味著FRET信號的強度與分泌的IFNβ濃度成正比。
 

圖8：IFNβ 檢測原理

人PBMC 400000 cells/ well的速度接種，用2'3’cGAMP刺激4h30min。在4h30min開始檢測，可以檢測到誘導(dǎo)的IFNβ分泌量。

圖9：IFNβ 檢測結(jié)果

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HTRF STING Pathway Cytokine Assay

AlphaLISA STING Pathway Cytokine Assay

優(yōu)寧維提供更多AlphaLISA和HTRF技術(shù)50多種細胞因子檢測試劑盒以及80多種磷酸白蛋白和總蛋白檢測試劑盒。

均相技術(shù)需要使用搭載有相應(yīng)模塊的酶標(biāo)儀進行讀值，優(yōu)寧維推薦PE VICTOR Nivo?多功能酶標(biāo)儀：
 
VICTOR Nivo?多功能酶標(biāo)儀配置六種檢測模式：分別是熒光強度、化學(xué)發(fā)光、吸光度（紫外線和可見光)、時間分辨熒光、熒光偏振、Alpha；同時模塊化設(shè)計可選配分液器，自動進板系統(tǒng)和氣體控制選件；并且為長時程細胞檢測等需要臨界溫度的檢測提供了溫度控制功能（最高65度）

廣泛應(yīng)用于核酸/蛋白定量、ELISA、酶活動力學(xué)、GPCR、激酶檢測、離子通道、線粒體膜電位、表觀遺傳學(xué)分析、分子相互作用、結(jié)合分析、凝集反應(yīng)、報告基因檢測、BRET測定、細胞活力、細胞增殖、細胞凋亡、細胞毒性、細胞膜的完整性和膜的溶解、細菌粘附、細菌鑒定、食品毒素、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物、激素檢測等幾乎所有涉及微孔板的實驗與檢測。 

體積小巧，放置于密閉操作空間內(nèi)

VICTOR Nivo?的核心光路是一個旋轉(zhuǎn)32位濾光片轉(zhuǎn)輪。完全配置之后，系統(tǒng)可檢測大量染料，且比光柵系統(tǒng)具有更好的靈敏度和更大范圍的高信價比。具有以下特點：
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·對于在加樣前后需要直接檢測的實驗，如閃光型化學(xué)發(fā)光快速動力學(xué)檢測，您可以選配加樣器模塊。這種雙注射器加樣裝置，可以檢測螢光素酶雙報告基因?qū)嶒?，如我們的Twinlite技術(shù)?？筛鶕?jù)實驗需要在每孔內(nèi)加入小體積樣品，隨后同時進行檢測。該系統(tǒng)非常方便進行初始化、清洗及維護，并且在自動加樣以之前會自動檢測孔板是否已放置到儀器內(nèi)，以防止加樣造成的系統(tǒng)污染。

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