作者：閔

ALK融合突變是非小細(xì)胞肺癌常見驅(qū)動基因突變之一，因其靶向藥使用時間長，平均生存期長，也被病友們戲稱為“鉆石突變”。由于ALK融合突變發(fā)生概率僅5%-7%左右，不少病友都很羨慕ALK陽性的幸運(yùn)兒，也希望同樣的運(yùn)氣降落在自己身上，于是如何認(rèn)識ALK融合突變、如何檢測ALK突變以及如何看懂結(jié)果就成了需要回答的問題。

有很多病友會奇怪自己的基因檢測報告上有ALK突變卻被告知不能吃靶向藥，或者為什么自己的病理報告上寫著ALK（+）還要做基因檢測？想回答這些問題，我們需要去了解什么是ALK融合突變，究竟是怎么檢測的。

讓我們先了解一下主角ALK融合突變到底是怎么回事。ALK基因全稱為間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK），總共有29個外顯子。

為了方便理解，各位可以將它想象成一輛名為ALK的高鐵列車，而29個外顯子就是列車的29節(jié)車廂，那么“融合突變”就是指ALK的某節(jié)車廂斷裂并且與其他班次的列車車廂相接變成一個新的列車，最常見的是從ALK號列車的20號車廂處斷裂，并與另一輛名為“EML4”的基因重新拼接，如下所示。

已發(fā)現(xiàn)的所有ALK基因融合突變都是在ALK基因外顯子20處發(fā)生斷裂，而EML4斷裂點(diǎn)有外顯子2/6/13/14/15/17/18/20，即上圖中與斷裂后的ALK基因20號外顯子重新連接的不但可以是EML4基因13號外顯子，也可以是其他外顯子。

上面例子可簡稱為“E13:A20”，即代表EML4外顯子13與ALK外顯子20融合，有些基因檢測報告的結(jié)果也采用這種縮寫。不同的融合類型使用靶向藥的效果也不同，這是后話在此不過多贅述。

隨著研究進(jìn)步，更多的ALK基因融合伴侶被發(fā)現(xiàn)，ALK基因20外顯子斷裂后不僅可能與EML4基因融合，還可能有與KIF5B基因、KLC1基因、TFG基因、HIP1基因等等融合，此類也成為罕見ALK融合突變。

無論是常見融合類型還是罕見融合類型理論上都可以考慮使用ALK抑制劑，如克唑替尼、阿來替尼等等，但假如未發(fā)生斷裂，僅在ALK基因自身某位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變，這種不屬于融合突變，不推薦使用靶向藥，如下圖所示。融合突變與點(diǎn)突變雖然都屬于基因突變范疇，但是類型不同、意義不同，好比坐錯座位（點(diǎn)突變）、車廂重新拼接（融合突變）都是高鐵故障卻是完全兩回事，因此不能將兩種突變類型直接等同。

1.IHC免疫組化法就是平常病理診斷用到的免疫組化技術(shù)，簡單的說就是檢查不同指標(biāo)時需要使用對應(yīng)的抗體將細(xì)胞染色，根據(jù)染色強(qiáng)度評估陰/陽性。目前可選擇的ALK抗體有4種包括ALK1、5A4、D5F3 以及 1A4，其中非Ventana D5F3抗體因為特異性略低僅適合用于初篩，且實際臨床應(yīng)用也較少。Ventana D5F3抗體的靈敏度和特異性能夠達(dá)到95%-100%，專家共識推薦優(yōu)先使用。

2.熒光原位雜交FISH被認(rèn)為是融合/重排突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，原理簡單來說就是用一個紅色標(biāo)簽標(biāo)記ALK基因其他位置，另外一個綠色標(biāo)簽標(biāo)記ALK基因20外顯子，當(dāng)兩個標(biāo)簽重疊時熒光下觀察到黃色信號（紅色綠色重疊對外顯示黃色）說明未發(fā)生ALK基因斷裂即沒有ALK融合突變，而當(dāng)兩個標(biāo)簽分開時則說明ALK基因發(fā)生斷裂即可能有ALK融合突變，理論上FISH法可檢測所有ALK融合突變類型，如下所示。

3.熒光定量PCR（RT-PCR）是一種快速簡便的檢測方式，其利用DNA/RNA復(fù)制原理，用特異性的上/下游引物將目標(biāo)片段（比如ALK基因中某一段）特定選中并按照指數(shù)倍復(fù)制擴(kuò)增，根據(jù)產(chǎn)生的熒光信號判讀結(jié)果。

仍以E13:A20融合類型為例，因為有文獻(xiàn)報道過這個融合類型，所以可設(shè)計特定識別這個突變的引物A和B，然后在檢測時如果發(fā)生該融合，特定的上下游引物A和B會結(jié)合在融合后的基因片段兩端。好比AB兩個警察只負(fù)責(zé)抓捕叫“E13 : A20”的犯人，一旦發(fā)現(xiàn)他出現(xiàn)就會固定一頭一尾的逮住他，但對別的犯人（融合類型）就會自由放行。引物成功結(jié)合后就執(zhí)行循環(huán)指數(shù)倍復(fù)制擴(kuò)增并產(chǎn)生熒光信號，當(dāng)復(fù)制擴(kuò)增到足以探測到的量即表明存在E13:A20融合突變，如下：

4.二代測序NGS是近年來興起的一種檢測技術(shù)，因其通量大、檢測類型全面的特點(diǎn)能更好滿足臨床需要，所以推廣迅速并成為現(xiàn)在最常用的腫瘤基因檢測技術(shù)。二代測序的原理較為復(fù)雜，在這不做過多贅述，簡單描述即通過二代測序檢測可以明確待檢測基因全長的情況，而并非其中某一個片段，因此無論是待檢測基因是發(fā)生點(diǎn)突變、融合/重排等都可以檢測。

是不是還有點(diǎn)不太理解？那還是用高鐵列車的例子，待檢測基因還是以ALK基因為例，二代測序就相當(dāng)于每個車廂的乘務(wù)員開始從頭到尾每個座位查票，坐錯座位的（點(diǎn)突變）、多了個座位的（插入突變）、車廂接錯了的（融合/重排突變）一個都跑不了，只要發(fā)生了這些問題都能查出來。

雖然這四種檢測方法都可以用于檢測ALK融合突變，但各自也有優(yōu)劣，結(jié)合2022年v1版NCCN指南對于四種檢測方法的總結(jié)，僅就ALK基因檢測來說，F(xiàn)ISH法還是首選金標(biāo)準(zhǔn)方法；IHC法因為簡單便宜可用于篩查，并且經(jīng)FDA許可的抗體（Ventana D5F3）可用于獨(dú)立檢測ALK融合無需FISH驗證；NGS法也可以用于ALK融合檢測，且可以同時檢測其他驅(qū)動基因，符合當(dāng)下臨床需求；RT-PCR法也可以使用，但對于一些罕見融合無法檢測。

很多病友看到病理報告的免疫組化結(jié)果上寫著“ALK Pos（+），ALK Neg（-），ALK D5F3（+/-）”或者“ALK VENTANA（+/-）”的字樣，立馬感覺頭都大了，怎么這么多ALK又是陰性又是陽性的，那到底自己是不是有ALK融合突變呢？

這里我們要搞清楚這些指標(biāo)分別代表的含義，“ALK Pos（+），ALK Neg（-）”分別代表的是ALK檢測陽性對照品（Pos）和ALK檢測陰性對照品（Neg），所謂的對照品就是和待檢測的病人樣本一起檢測并經(jīng)歷整個實驗過程，當(dāng)這兩個樣品的檢測結(jié)果正常時，也就是Pos結(jié)果為（+），Neg結(jié)果為（-）時，代表此次檢測過程操作正常沒有差錯且結(jié)果可信，滿足這個條件后，如果各位還能能看到“ALK （+）”、“ALK D5F3（+）”或者“ALK VENTANA（+）”字樣時，那就要恭喜你可能是ALK陽性了，但非VENTANA D5F3抗體檢測結(jié)果仍需要基因檢測加以驗證。

那么回到最初的問題——為什么基因檢測報告上有ALK突變卻不能吃靶向藥，又為什么有些病理報告上提示ALK（+）還需要做基因檢測？

第一個基因檢測報告的問題很簡單，分清楚是ALK點(diǎn)突變還是融合突變，只有融合突變才適合使用ALK-TKI；

第二個病理報告的問題首先分清楚是ALK（+）還是ALK Pos（+），前面我們說過了ALK Pos（+）代表的是陽性對照品檢測成功，只是用來作為參照物確保檢測過程正常的，并不代表病人樣本檢測結(jié)果；其次即便是ALK（+）也要區(qū)分是不是Ventana D5F3抗體，若是標(biāo)注Ventana或者D5F3的后綴，那么就可以直接指導(dǎo)用藥，基本不需要基因檢測確認(rèn)，而若未明確的，那么此類抗體的靈敏度和特異性相對差一些，理論上確實需要其他方法加以驗證。

選擇驗證方法時雖然FISH法是ALK融合檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于一次實驗只能排查有沒有ALK融合，不能兼顧其他驅(qū)動基因是否有突變，而眾所周知非小細(xì)胞肺癌的驅(qū)動基因有9個，為節(jié)約樣本并提高效率，目前較為習(xí)慣的方法是采用NGS或者RT-PCR方法加以驗證，技術(shù)角度推薦考慮NGS法。