科學(xué)技術(shù)振興機(jī)構(gòu)（ＪＳＴ）

東京大學(xué)

開發(fā)在細(xì)胞外復(fù)制和進(jìn)化的人工基因組DNA ~期待構(gòu)筑自主增殖進(jìn)化的人工細(xì)胞~

重點(diǎn) 生物可以利用寫在基因組DNA上的信息復(fù)制DNA進(jìn)行進(jìn)化，但具有這種能力的人造物體至今還沒有被制造出來(lái)。 本研究通過(guò)利用人工基因組DNA和無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，世界上首次成功地進(jìn)化出了在細(xì)胞外表達(dá)基因的同時(shí)進(jìn)行復(fù)制的DNA。 通過(guò)向該人工基因組DNA中添加基因，將來(lái)可以構(gòu)建能夠自主增殖的人工細(xì)胞，有望為高效的有用物質(zhì)生產(chǎn)做出貢獻(xiàn)。

在JST戰(zhàn)略性創(chuàng)造研究推進(jìn)事業(yè)中，東京大學(xué)研究生院綜合文化研究科廣域科學(xué)專業(yè)附屬先進(jìn)科學(xué)研究機(jī)構(gòu)/生物普遍性聯(lián)合研究機(jī)構(gòu)的市橋伯一教授等人僅使用核酸和蛋白質(zhì)等非生物材料，在細(xì)胞外首次成功地進(jìn)行了來(lái)自生物特征DNA的基因表達(dá)和持續(xù)復(fù)制的進(jìn)化。增加和進(jìn)化是生物的一大特征，但具有這種特征的人造物體至今還沒有被制造出來(lái)。 本研究小組通過(guò)使用含有DNA復(fù)制所需的2個(gè)基因的環(huán)狀DNA (人工基因組DNA )和無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系注1 )，成功地將基因翻譯成蛋白質(zhì)，通過(guò)其翻譯的蛋白質(zhì)復(fù)制了原來(lái)的環(huán)狀DNA。 并且通過(guò)將這個(gè)DNA復(fù)制周期持續(xù)約60天，成功進(jìn)化成了復(fù)制效率上升了約10倍的DNA。 如果在這次開發(fā)的人工基因組DNA中追加轉(zhuǎn)錄翻譯所需的基因，將來(lái)只要提供氨基酸和堿基等低分子化合物，就可以發(fā)展成自主增殖的人工細(xì)胞。 如果產(chǎn)生了那樣的人工細(xì)胞，我們就可以期待現(xiàn)在進(jìn)行的醫(yī)藥品開發(fā)和食品生產(chǎn)等使用生物的有用物質(zhì)生產(chǎn)會(huì)變得更加穩(wěn)定和容易控制。 本研究成果于2021年11月16日(美國(guó)東部時(shí)間)在美國(guó)科學(xué)雜志《ACS SyntheticBiology》的在線版上公布。 本成果通過(guò)以下事業(yè)研究領(lǐng)域研究課題獲得。 戰(zhàn)略性創(chuàng)造研究推進(jìn)事業(yè)團(tuán)隊(duì)型研究( CREST ) 研究領(lǐng)域:“通過(guò)基因組尺度的DNA設(shè)計(jì)·合成創(chuàng)造細(xì)胞控制技術(shù)” (研究總結(jié):鹽見春彥慶應(yīng)義塾大學(xué)醫(yī)學(xué)部教授) 研究課題名稱:“開發(fā)自我再生產(chǎn)和進(jìn)化的人工基因組復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)” 研究代表人:市橋伯一(東京大學(xué)研究生院綜合文化研究科教授) 研究期間:令和2年11月~令和8年3月 在這個(gè)領(lǐng)域，JST的目標(biāo)是闡明基因組的工作原理和創(chuàng)造細(xì)胞利用的基礎(chǔ)技術(shù)。 上述研究課題的目標(biāo)是開發(fā)一邊自我再生產(chǎn)一邊復(fù)制進(jìn)化的人工基因組DNA。

<研究背景和經(jīng)過(guò)>

增加和進(jìn)化是生物的一大特征。 由于生物具有增加的能力，可以用于食物和醫(yī)藥品等廉價(jià)的生產(chǎn)。 因?yàn)榭梢赃M(jìn)一步進(jìn)化，所以也可以改良品種。 但是，由于生物不能適合人類，所以使用生物制作的控制性和穩(wěn)定性有限。 如果能夠制造出增加并具有進(jìn)化能力的人工分子系統(tǒng)的話，就可以期待能夠更加高效穩(wěn)定地進(jìn)行至今為止依賴于生物的有用物質(zhì)生產(chǎn)。 對(duì)生物“不斷增加進(jìn)化的能力”來(lái)說(shuō)，最重要的條件是要長(zhǎng)期持續(xù)復(fù)制生物設(shè)計(jì)圖即基因組DNA。 在這個(gè)復(fù)制過(guò)程中，基因組DNA發(fā)生變異，如果該變異有利于子孫的數(shù)量和生存，那么該變異就會(huì)通過(guò)在群體中傳播而發(fā)生進(jìn)化。 因此，為了開發(fā)不斷增加進(jìn)化的人工分子系統(tǒng)，首先需要長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)進(jìn)行DNA的復(fù)制。 要像生物一樣進(jìn)一步進(jìn)化，并不只是復(fù)制DNA就可以了，需要翻譯寫在DNA上的信息(基因)使蛋白質(zhì)表達(dá)，根據(jù)其蛋白質(zhì)復(fù)制DNA。 迄今為止，還沒有實(shí)現(xiàn)這種DNA復(fù)制所需的基因的表達(dá)和由此產(chǎn)生的DNA復(fù)制同時(shí)發(fā)生的反應(yīng)體系構(gòu)建。 造成這種情況的一大障礙是，DNA復(fù)制所需的基因很多(大腸桿菌型的DNA復(fù)制約20種，病毒型需要4種)，而且其中一部分需要高濃度的蛋白質(zhì)，所以現(xiàn)在的無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)很難以充分提供所有的基因。

<研究?jī)?nèi)容> 因此，本研究小組決定人工制作出用更少的基因、低濃度的蛋白質(zhì)就能達(dá)成的DNA復(fù)制結(jié)構(gòu)，而不是像生物使用的那樣精巧但需要大量基因的復(fù)雜的DNA復(fù)制結(jié)構(gòu)。 在這次使用的DNA復(fù)制機(jī)制中，只需要2種基因( Phi29 DNA復(fù)制酶注2 )和Cre重組酶注3 ) )就可以復(fù)制環(huán)狀DNA (稱為人工基因組DNA ) (圖1 )。 首先，Phi29 DNA復(fù)制酶一邊從環(huán)狀DNA中的不特定位置剝離雙鏈DNA，一邊合成互補(bǔ)DNA。 雖然作為模板的DNA呈環(huán)狀，但由于自身合成的DNA鏈會(huì)被剝離，進(jìn)一步繼續(xù)合成，最終將形成長(zhǎng)達(dá)數(shù)十公里的堿基對(duì)的長(zhǎng)直鏈狀單鏈DNA。 另外，DNA復(fù)制酶合成互補(bǔ)鏈，形成長(zhǎng)雙鏈DNA后，Cre重組酶發(fā)生作用，對(duì)被稱為loxP的34堿基對(duì)的DNA序列之間發(fā)生同源重組。 因?yàn)樵瓉?lái)的環(huán)狀DNA中含有1個(gè)loxP序列，所以其間如果發(fā)生同源重組，環(huán)狀DNA就會(huì)再生。 以上的DNA復(fù)制機(jī)制只需要兩個(gè)基因就可以進(jìn)行遞歸環(huán)狀DNA的復(fù)制。 另外，預(yù)計(jì)這兩種蛋白質(zhì)在低濃度下也可以充分發(fā)揮作用，在現(xiàn)在的無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中可以充分表達(dá)量。 

  本研究首先驗(yàn)證了該人工基因組DNA是否可以持續(xù)復(fù)制。 用無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)對(duì)人工基因組DNA進(jìn)行了圖1所示的反應(yīng)。 于是，DNA被復(fù)制了1000倍以上(圖2，第1回合)。 為了確認(rèn)DNA的持續(xù)復(fù)制，取出一部分反應(yīng)液用新的無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯液稀釋，同樣嘗試進(jìn)行下一輪的轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制，結(jié)果DNA增加了2倍左右(圖2、第2回合)。 照這個(gè)樣子反復(fù)稀釋和反應(yīng)多次傳代，DNA的增加就會(huì)慢慢惡化，8次傳代后DNA完全不增加了。 其理由是在復(fù)制中會(huì)發(fā)生因復(fù)制錯(cuò)誤而破壞基因功能的變異，如果反復(fù)復(fù)制，總有一天基因會(huì)損壞。 問題是，擁有這些壞基因的DNA也會(huì)繼續(xù)被其他從正?；蛑斜磉_(dá)的蛋白質(zhì)復(fù)制，最終正?；蛳Вw上停止復(fù)制(圖3左)。除去具有這種壞基因的DNA的方法之一是，像細(xì)胞一樣導(dǎo)入分區(qū)結(jié)構(gòu)，將每個(gè)細(xì)胞的基因組DNA數(shù)量限定為少數(shù)(如果可能的話為1個(gè))。 這樣一來(lái)，帶有壞基因的DNA由于無(wú)法制造正常的蛋白質(zhì)而無(wú)法復(fù)制，不久應(yīng)該就會(huì)被稀釋(圖3右)。 作為這樣的分區(qū)結(jié)構(gòu)，使用了直徑0.5~0.8微米( m )的油中水滴。油中水滴可以通過(guò)在礦物油中加入表面活性劑和反應(yīng)溶液，劇烈攪拌來(lái)制作。 

 在這樣制作的水滴中封入人工基因組DNA和無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯反應(yīng)液，在30度下進(jìn)行16小時(shí)的圖1所示的DNA復(fù)制反應(yīng)。 然后，如圖4A所示用含有新的無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)的水滴稀釋，進(jìn)行下一輪的反應(yīng)。 在這樣的分區(qū)結(jié)構(gòu)中進(jìn)行傳代反應(yīng)后，與之前的結(jié)果不同，經(jīng)過(guò)8個(gè)回合后復(fù)制仍持續(xù)(圖4B )。 而且當(dāng)初DNA濃度有逐漸下降的趨勢(shì)，但到了18回合后突然變得經(jīng)常增加，能夠持續(xù)進(jìn)行DNA復(fù)制到60回合( 60天，相當(dāng)于140代)。 在30個(gè)回合的時(shí)候，分離出18個(gè)DNA，對(duì)其序列進(jìn)行調(diào)查，平均有7個(gè)變異，其中5個(gè)是過(guò)半數(shù)的DNA共有的。 另外，分離出的多數(shù)DNA的復(fù)制能力與原來(lái)的DNA相比最大上升到了約10倍(圖5 )。 這表明發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化。 這里重要的是，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，研究者并不是有意選擇了復(fù)制量特別高的DNA。 研究人員進(jìn)行的只是每天調(diào)整、稀釋水滴，用30度加熱。 作為操作，與傳代培養(yǎng)微生物沒有太大差別。 核酸和蛋白質(zhì)等無(wú)生物分子的集合只是“培養(yǎng)”，DNA就開始自由進(jìn)化，這一點(diǎn)具有本研究的新穎性。

另一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，DNA濃度的推移以劇烈波動(dòng)的方式反復(fù)上升和下降(圖4B、20回合和50回合左右達(dá)到極大)。 我認(rèn)為這種現(xiàn)象可能是因?yàn)槌霈F(xiàn)了寄生型的DNA。 實(shí)際上，研究了DNA濃度每20個(gè)回合增加的DNA，發(fā)現(xiàn)除了原來(lái)的人工基因組DNA以外，由缺失了DNA復(fù)制酶和重組酶兩種基因的100個(gè)堿基長(zhǎng)度左右的重復(fù)結(jié)構(gòu)構(gòu)成的DNA過(guò)度擴(kuò)增。 由于這個(gè)DNA不具備DNA復(fù)制所需的基因，所以不能單獨(dú)增加，但如果在同一區(qū)域內(nèi)存在正常的DNA，就可以寄生于它而增加。 同樣的寄生型復(fù)制體的出現(xiàn)和振動(dòng)的濃度推移，在本研究的作者們進(jìn)行的RNA進(jìn)化實(shí)驗(yàn)注4 )中也被觀察到( Furubayashi et al eLIFE 2020 )，可以認(rèn)為同樣的現(xiàn)象在DNA的情況下也發(fā)生了。 寄生型復(fù)制體無(wú)論是RNA還是DNA都很快出現(xiàn)了，這暗示著寄生種的出現(xiàn)對(duì)基因組復(fù)制系統(tǒng)來(lái)說(shuō)是普遍的現(xiàn)象。

<今后的展開> 雖然現(xiàn)在的人工基因組DNA中只搭載了DNA復(fù)制所需的2個(gè)基因，但可以通過(guò)導(dǎo)入其他基因來(lái)擴(kuò)展人工基因組DNA所具有的功能。 例如，由于現(xiàn)在放在無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中的RNA和蛋白質(zhì)也能從基因組DNA中表達(dá)，今后，如果載有轉(zhuǎn)錄翻譯所需的所有基因，只需提供氨基酸和堿基等低分子化合物，就可以發(fā)展成自主增殖的人工分子系統(tǒng) 。導(dǎo)入膜合成基因的話，有可能產(chǎn)生細(xì)胞膜。 另外，如果翻譯的蛋白質(zhì)功能不充分，也可以通過(guò)進(jìn)化來(lái)提高其功能。 如果以本研究開發(fā)的人工基因組DNA為核心，則可以期待構(gòu)建出自主增殖的人工細(xì)胞。 可以認(rèn)為，如果形成這種自主增殖的人工分子系統(tǒng)，現(xiàn)在依賴生物的醫(yī)藥品開發(fā)和食品生產(chǎn)等就可以被這種系統(tǒng)取代。 生物雖然結(jié)實(shí)穩(wěn)定，但是不能方便人類。 另外，生物的工作原理中還留有很多黑匣子。 因此，使用生物制造總是有限制。 另一方面，如果是人工構(gòu)筑的分子系統(tǒng)，則只包含必要的要素，全部可以用已知的物質(zhì)制作，所以設(shè)計(jì)和控制變得容易。 將來(lái)，通過(guò)使用這樣的人工系統(tǒng)，期待能夠更穩(wěn)定地控制目前使用生物的有用物質(zhì)的生產(chǎn)。

＜參考圖＞

圖1人工設(shè)計(jì)的DNA復(fù)制的結(jié)構(gòu)

由DNA表達(dá)2種蛋白質(zhì)，通過(guò)Phi29 DNA復(fù)制酶由環(huán)狀DNA合成雙鏈長(zhǎng)的直鏈狀DNA。 之后，Cre重組酶在分子內(nèi)發(fā)生同源重組，使環(huán)狀DNA再生。 這時(shí)產(chǎn)生的環(huán)狀DNA的大小本來(lái)就有可能大兩倍、三倍。 另外，也存在不變成環(huán)狀DNA，直接復(fù)制長(zhǎng)直鏈狀DNA的路徑。 這種DNA復(fù)制的結(jié)構(gòu)曾于2006年由海外小組提出，但由于Cre重組酶強(qiáng)烈阻礙DNA復(fù)制酶的功能，多年來(lái)一直未能實(shí)現(xiàn)( Forster et al 2006 Mol Sys Biol )。 在本研究組的前期研究中，獲得了抑制效果小的DNA復(fù)制酶突變體( Sakatani et al 2018 Sci Rep )，使本研究成為可能。

圖2在無(wú)分區(qū)結(jié)構(gòu)的條件下傳代時(shí)的DNA濃度推移

由DNA表達(dá)2種蛋白質(zhì)，通過(guò)Phi29 DNA復(fù)制酶由環(huán)狀DNA合成雙鏈長(zhǎng)的直鏈狀DNA。 之后，Cre重組酶在分子內(nèi)發(fā)生同源重組，使環(huán)狀DNA再生。 這時(shí)產(chǎn)生的環(huán)狀DNA的大小本來(lái)就有可能大兩倍、三倍。 另外，也存在不變成環(huán)狀DNA，直接復(fù)制長(zhǎng)直鏈狀DNA的路徑。 這種DNA復(fù)制的結(jié)構(gòu)曾于2006年由海外小組提出，但由于Cre重組酶強(qiáng)烈阻礙DNA復(fù)制酶的功能，多年來(lái)一直未能實(shí)現(xiàn)( Forster et al 2006 Mol Sys Biol )。 在本研究組的前期研究中，獲得了抑制效果小的DNA復(fù)制酶突變體( Sakatani et al 2018 Sci Rep )，使本研究成為可能。

圖3類似細(xì)胞分區(qū)結(jié)構(gòu)的效果

左)沒有分區(qū)結(jié)構(gòu)的時(shí)候，即使基因被破壞了的DNA也會(huì)和其他正常的DNA一樣被復(fù)制，所以無(wú)法被除去。 右)如果有分區(qū)結(jié)構(gòu)，每個(gè)分區(qū)的DNA為1分子的話，基因破壞了的DNA不會(huì)被復(fù)制，所以不久就會(huì)變得不被稀釋，從而被除去。

圖4在有地塊結(jié)構(gòu)的條件下傳代時(shí)的DNA濃度推移。

a )在油中水滴中進(jìn)行如圖1所示的反應(yīng)，在下一個(gè)回合中，用含有新的無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯反應(yīng)液的油中水滴稀釋，通過(guò)攪拌，使水滴內(nèi)部發(fā)生混合反應(yīng)。 b )在各回合中測(cè)量了DNA濃度。 獨(dú)立有兩個(gè)系列的實(shí)驗(yàn)，上面給出了其中的一個(gè)例子。 兩者的復(fù)制都持續(xù)到了最后。 在黑箭頭所示的回合中，由于DNA濃度在檢測(cè)靈敏度以下，因此一度取出DNA并人為放大后，再次返回到區(qū)內(nèi)。

圖5分離的DNA復(fù)制能力的比較

對(duì)在回合30中分離出的多個(gè)DNA進(jìn)行了圖1所示的轉(zhuǎn)錄·翻譯·復(fù)制反應(yīng)，比較了含有環(huán)狀、線性DNA的總DNA復(fù)制量。

<用語(yǔ)解說(shuō)> 注1 )無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng) 含有從細(xì)胞外編碼為DNA的基因轉(zhuǎn)錄RNA，翻譯成蛋白質(zhì)所需的所有因子的反應(yīng)液。 本研究特別是由清水義宏(現(xiàn)理化研究所生命功能科學(xué)研究中心無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成研究小組組長(zhǎng))等在東京大學(xué)上田卓也研究室開發(fā)的，全部由純化的已知蛋白質(zhì)和RNA構(gòu)成的重構(gòu)型物質(zhì)( PURE SYSTEM，Shimizu ) 注2 ) Phi29 DNA復(fù)制酶 枯草桿菌噬菌體phi29攜帶的DNA復(fù)制酶。 該酶可以以DNA和RNA為引物合成DNA鏈。 由于具有鏈置換活性，可以在分離雙鏈的同時(shí)繼續(xù)進(jìn)行DNA合成。 預(yù)計(jì)在本研究中，將通過(guò)轉(zhuǎn)錄酶制作的RNA片段作為引物進(jìn)行復(fù)制。 注3 ) Cre重組酶 大腸桿菌噬菌體P1攜帶的DNA重組酶。 可以重組被稱為loxP的34堿基長(zhǎng)度的序列。 本研究中使用的人工基因組DNA有一個(gè)loxP。 注4 ) RNA的進(jìn)化實(shí)驗(yàn) 本研究開發(fā)的這種持續(xù)復(fù)制進(jìn)化的系統(tǒng)，過(guò)去由本集團(tuán)的成員用RNA而不是DNA達(dá)成( Ichihashi et al.Nat Commun 2013 )。 但是，RNA基因組的情況下，可持續(xù)復(fù)制的RNA的長(zhǎng)度有限，難以添加基因，缺乏發(fā)展性。 與此相對(duì)，此次開發(fā)的DNA基因組目前沒有那樣的限制，可以追加多個(gè)基因，期待著各種各樣的應(yīng)用。