實驗室常用的分子診斷技術(shù)包括：PCR、Sanger 測序、二代基因測序(NGS)、原位雜交等，鑒于實際臨床工作中進行分子診斷的樣本類型（如進行原位雜交的樣本有血液、羊 水穿刺、腫瘤組織等）以及預(yù)期用途差別較大，而不同樣本類型對性能驗證的要求和難易程 度差別較大，建議結(jié)合實際情況酌情選擇與之相符合的性能驗證方案。

目前，實驗室常規(guī)開展的分子診斷項目以PCR技術(shù)最為常用，PCR技術(shù)又分為PCR定量檢測技術(shù)和PCR定性檢測技術(shù)。本文依據(jù)CNAS整理出采用PCR技術(shù)的分子診斷項目宜參考的性能驗證參數(shù)及方案。

一、PCR定性檢測項目

1. PCR 定性檢測選擇驗證的性能指標宜包括方法符合率、檢出限、抗干

擾能力、交叉反應(yīng)等。

2. 如果檢驗程序適用樣本類型包括血清與血漿，實驗室在臨床檢測時同時使用 血清與血漿，應(yīng)進行血清與血漿結(jié)果一致性的驗證。

3. 實驗室應(yīng)根據(jù)檢測項目的預(yù)期用途以及生產(chǎn)制造商聲明，選擇對檢測結(jié)果質(zhì)量有重要影響的參數(shù)進行驗證。

1. 方法符合率：通過參比方法比較。

① 樣本：

◆ 選取陰性樣本至少 5 例、陽性樣本（宜包含弱陽性/低擴增的樣本）， 一般不少于 10 例樣本。

注 1：罕見或少見病種的項目，可酌情減少樣本例數(shù)。

注 2：若弱陽性/低擴增樣本不好獲取，可用適當稀釋陽性樣本獲得類似的效果。

② 驗證方法：

◆ 按照患者樣本檢測程序，采用參比方法和候選方法平行檢測。

◆ 將所有檢測結(jié)果按下表匯總填表，計算符合率。

陽性符合率=a/(a+c)×100%

陰性符合率=d/(b+d)×100%

總符合率=(a+d)/( a+b+c+d)×100%

③ 判斷標準：

◆ 實驗室性能驗證結(jié)果的判斷標準是廠商或研發(fā)者在試劑盒或檢測系統(tǒng)說明書中聲明的性能指標。

2. 檢出限：驗證廠家試劑使用說明書等有聲明檢出限。

① 樣本：

◆ 定值標準物質(zhì)（如：國際參考品、國家參考品、廠家參考品）。

◆ 對于報告具體基因型的方法，其選用的標準物質(zhì)需包括所有的突變類型。

② 驗證方法：

◆ 使用定值標準物質(zhì)的樣本梯度稀釋至廠家聲明的檢出限濃度。 

◆ 可重復(fù)測定 5 次或在不同批內(nèi)對該濃度樣本進行 20 次重復(fù)測定（如測定 5 天， 每天測定 4 份樣本）。

◆ 稀釋液可根據(jù)情況選用廠家提供的稀釋液或陰性血清，該陰性血清除被驗證的目標物必須陰性外，所含干擾物質(zhì)濃度必須在廠家聲明的范圍之內(nèi)。

③ 判斷標準：

◆ 如果是 5 次重復(fù)檢測，必須 100%檢出靶核酸；

◆ 如果是 20 次檢測，必須檢出 至少 18 次靶核酸。

3. 交叉反應(yīng)：

對于病原體核酸檢測來說，主要指與檢測對象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸，宜在病原體感染的醫(yī)學(xué)決定水平進行驗證。

① 驗證方法：

◆ 對于病原體核酸檢測，取一定濃度與待測核酸可能存在交叉反應(yīng)的病原體加入樣本保存液或經(jīng)確認為陰性的樣本中，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復(fù)檢測3次；

◆ 對于基因型檢測，取一定濃度經(jīng)其它方法（如測序等）確認為其它基因型的樣本，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復(fù)檢測3次。

② 判斷標準：

◆ 結(jié)果應(yīng)為陰性。 

4. 抗干擾能力

分子診斷常見的干擾物質(zhì)主要包括血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、免疫球蛋白 G、類風(fēng)濕因子和藥物等。實驗室可根據(jù)臨床需求、廠家聲明和樣本特點（實際可能存在的干擾物質(zhì)及達到的濃度）選擇需要驗證的干擾物質(zhì)及濃度。需要時，也應(yīng)評估抗凝劑和樣本保存液等對結(jié)果的影響。

① 驗證方法：

實驗室可根據(jù)實際情況選擇驗證方案。

◆ 方案 1：實驗組為在弱陽性樣本中加入干擾物質(zhì)溶液（對照組加入等量的溶劑），使得干擾物質(zhì)的終濃度與廠家聲明的濃度相同，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復(fù)測定 3 次以上。

◆ 方案 2：選取含待驗證的高濃度水平干擾物質(zhì)且經(jīng)確認不含被測物的臨床樣本作為實驗組，選取含低濃度水平干擾物質(zhì)且經(jīng)確認不含被測物的臨床樣本作為對照組。分別在實驗組和對照組中加入弱陽性樣本（量小于 10%），與常規(guī)樣本一樣處理，每組至少重復(fù)檢測 3 次。

② 判斷標準：

◆ 方案 1：弱陽性樣本檢測仍為弱陽性結(jié)果，則驗證通過。

◆ 方案 2：如果對照組和實驗組結(jié)果均為弱陽性，說明在驗證濃度下，干擾物質(zhì)對測定無顯著影響。如果對照組結(jié)果為弱陽性，實驗組結(jié)果為陰性，說明在驗證濃度下，干擾物質(zhì)對測定有顯著影響。

二、PCR定量檢測項目

1. PCR 定量檢測選擇驗證的性能指標宜包括測量正確度、測量精密度（含測量重復(fù)性和測量中間精密度）、測量不確定度、分析特異性（含抗干擾能力）、分析靈敏度、檢出限和定量限、線性區(qū)間（可報告區(qū)間）等。

2. 如果檢驗程序適用樣本類型包括血清與血漿，實驗室在臨床檢測時同時使用 血清與血漿，應(yīng)進行血清與血漿結(jié)果一致性的驗證。

3. 驗室應(yīng)根據(jù)檢測項目的預(yù)期用途以及生產(chǎn)制造商聲明，選擇對檢測結(jié)果質(zhì)量有重要影響的參數(shù)進行驗證。

1. 正確度驗證：實驗室可采用偏倚評估、回收試驗、與參考方法比對等方式進行正確度的驗證。

① 偏倚評估：

◆ 樣本: 按照如下優(yōu)先順序選用具有互換性的標準物質(zhì)或基質(zhì)與待測樣本相類似的標準物質(zhì)：

1)有證標準物質(zhì)（CRM），包括國家標準物質(zhì)（如 GBW）、國際標準物質(zhì)（如WHO、IFCC）、CNAS 認可的標準物質(zhì)生產(chǎn)者（RMP）提供的有證標準物質(zhì)、與我國簽署互認協(xié)議的其他國家計量機構(gòu)提供的有證標準物質(zhì)（如NIST、JSCC）等；

2)標準物質(zhì)（RM），如廠商提供的工作標準品；

3)正確度控制品；

4)正確度驗證室間質(zhì)評樣本，如 CNAS 認可的 PTP 提供的正確度驗證樣本。宜根據(jù)測量區(qū)間選用至少 2 個濃度水平的標準物質(zhì)樣本。

◆驗證方法：

每個濃度水平的標準物質(zhì)樣本至少每天重復(fù)測定 2 次，連續(xù)測定 5 天，記錄檢測結(jié)果，計算全部檢測結(jié)果的均值，并按公式計算偏倚。

偏倚 = 結(jié)果均值 ? 參考值

② 與參考方法比對：

◆ 樣本：

適宜的臨床樣本，不少于 8 份，被測物濃度在測量區(qū)間內(nèi)均勻分布，并關(guān)注醫(yī)學(xué)決定水平。

◆ 驗證方法：

按照患者樣本檢測程序，采用參比方法和候選方法平行檢測。

按照制造商說明書或作業(yè)指導(dǎo)書規(guī)定的方法對實驗方法進行校準/校準驗證，宜在相同時段內(nèi)完成對同一樣本的兩種方法平行檢測，每份樣本每個檢測方法重復(fù)檢測 3 次，計算每份樣本兩種方法檢測結(jié)果的均值，并按照公式計算偏倚。

偏倚 = 結(jié)果均值 ? 參考值

2. 精密度驗證：精密度驗證應(yīng)包括重復(fù)性和中間精密度。

① 樣本：

◆ 可采用新鮮或凍存的樣本。

◆ 當樣本中待測物不穩(wěn)定或樣本不易得到時，也可考慮使用基質(zhì)與實際待檢樣本相似的樣本，如質(zhì)控品。

◆ 應(yīng)至少評估 2 個水平樣本的不精密度。當 2 個水平樣本的不精密度有顯著差異時，建議增加為 3 個水平。

◆ 所選樣本的被測物水平應(yīng)在測量區(qū)間內(nèi)，適宜時，至少有 1 個樣本的被測物水平在醫(yī)學(xué)決定水平左右。

注意：

注 1：通常較高值樣本的不精密度較小，較低值樣本的不精密度偏大。對低值有臨床意

義的檢測項目，宜評估有判斷價值的低水平樣本的不精密度。

注 2：如檢測結(jié)果沒有明確的醫(yī)學(xué)決定水平，可在參考區(qū)間上限左右選一個濃度，再根

據(jù)檢驗項目的特點在測量區(qū)間內(nèi)選擇另一個濃度。

注 3：如與廠商或文獻報導(dǎo)的不精密度比較，所選樣本水平宜與被比較的樣本水平接近。

② 重復(fù)性驗證：

◆ 驗證方法： 對樣本進行至少 10 次重復(fù)測定，計算均值、SD 和 CV。

◆ 質(zhì)量控制： 實驗過程中應(yīng)至少檢測一個質(zhì)控品。當質(zhì)控結(jié)果失控時，不論實驗結(jié)果是否滿意都應(yīng)棄去不用，重新進行試驗以取得全部實驗數(shù)據(jù)。

◆ 數(shù)據(jù)分析：依據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算均值和標準差。

③ 同時驗證重復(fù)性和中間精密度：

◆ 驗證方法：每天檢測 1 個分析批，每批檢測 2 個水平的樣本，每個樣本重復(fù)檢測 3～5 次，連續(xù)檢測 5 天。在每一批次測量中，應(yīng)同時測量質(zhì)控品。

◆ 數(shù)據(jù)分析： 

3. 可報告范圍驗證：:定量分析方法的可報告范圍是臨床實驗室發(fā)出檢驗報告的依據(jù)之一，可報告范圍的驗證包括可報告低限（定量下限）與可報告高限（定量上限×樣本最大稀釋倍數(shù)）。

① 樣本

◆ 宜選擇與待測樣本具有相同基質(zhì)的樣本。

② 樣本準備

◆ 以血清樣本為例。

低值樣本準備：將待測樣本（含被分析物）用混合人血清（含被分析物濃度水平較低）或 5%牛血清白蛋白生理鹽水溶液進行稀釋，產(chǎn)生接近于方法測量區(qū)間低限（定量下限）濃度水平的樣本，通常為 3～5 個濃度水平，濃度間隔應(yīng)小于測量區(qū)間低限的 20%。

高值樣本準備：使用混合血清或 5%牛血清白蛋白生理鹽水溶液或測定方法要求的稀釋液對高值待測樣本（必要時可添加被分析物，并計算出理論值）進行稀釋，使其接近于線性范圍的上 1/3 區(qū)域內(nèi)，并記錄稀釋倍數(shù)。至少選用 3 個高濃度樣本，稀釋倍數(shù)應(yīng)為方法性能標明的最大稀釋倍數(shù)并適當增加或減小稀釋比例。

③ 驗證方法

◆ 在一次運行中將每個低值樣本重復(fù)測定 5～10 次，每個高值樣本重復(fù)測定 3次。

④ 數(shù)據(jù)分析

◆ 分別計算每個低值樣本的均值、SD、CV 值。

◆ 對高值樣本，計算乘以稀釋倍數(shù)后的還原濃度和相對偏差。

⑤ 可報告范圍的確定

◆ 可報告范圍低限（定量下限）

以方法性能標示的總誤差或不確定度為可接受界值，從低值樣本結(jié)果數(shù)據(jù)中選取總誤差或不確定度等于或小于預(yù)期值的最低濃度水平作為可報告范圍低限。

◆ 可報告范圍高限

選取還原濃度與理論濃度的偏差（%）等于或小于方法預(yù)期偏倚值時的最大稀釋倍數(shù)為方法推薦的最大稀釋倍數(shù)，測量區(qū)間的高限與最大稀釋倍數(shù)的乘積為該方法可報告范圍的高限。可報告范圍高限的確定應(yīng)考慮臨床需求。

注：超出可報告范圍時，實驗室檢測結(jié)果不能滿足其預(yù)期總誤差或不確定度的要求。

4. 分析特異性驗證

① 樣本

◆ 宜選取被測量水平不同的 2 個樣本為基礎(chǔ)樣本，可參考醫(yī)學(xué)決定水平或參考區(qū)間限值。

② 干擾物質(zhì)選擇

◆ 宜根據(jù)檢測方法的原理和預(yù)期用途選擇常見的可能產(chǎn)生干擾作用的物質(zhì)。

③驗證方法

◆ 干擾物原液中干擾物的濃度應(yīng)高于實驗濃度 20 倍以上，以減少對基礎(chǔ)樣本基質(zhì)的稀釋作用。

◆ 重復(fù)檢測（n≥3)實驗樣本和對照樣本，分別計算 2 組結(jié)果均值，和均值間的差值。

④ 判斷標準

◆ 滿足干擾標準時的最高干擾物濃度，應(yīng)符合檢測方法規(guī)定的要求。

5. 分析靈敏度驗證

① 樣本

◆ 宜選取與待測樣本相同基質(zhì)的樣本，濃度或活性已知，且水平處于參考區(qū)間上限（或醫(yī)學(xué)決定水平）附近。

② 驗證方法

◆ 在檢測方法正常運行的條件下重復(fù)檢測樣本 3 次。

③ 判斷標準

◆ 實驗結(jié)果符合檢測程序規(guī)定的范圍，如企業(yè)標準。 

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