專利名稱：鴨坦布蘇病毒多克隆抗體及其制備方法 技術領域： 本發(fā)明屬于家禽基因工程技術領域，具體涉及鴨坦布蘇病毒多克隆抗體及其制備方法。 背景技術： 2010年4月以來，我國主要蛋鴨養(yǎng)殖區(qū)福建、山東、浙江、上海、江蘇等地陸續(xù)暴發(fā)一種以蛋鴨、種鴨產(chǎn)蛋驟然大幅下降為主要臨床特征、以出血性卵巢炎為主要病變特征的急性傳染病，造成約1. 2億只蛋鴨和1500萬只肉鴨發(fā)病，經(jīng)濟損失達數(shù)十億元。隨著病原學研究的深入，該病被確診是由一種新型黃病毒鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)引起的。鑒于當前如此嚴峻的形勢，建立鴨坦布蘇病毒抗體對該病的主動免疫保護 和流行病學調(diào)查具有極其重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，鴨坦布蘇病毒編碼結構蛋白(C、PrM和E)和非結構蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5)。其中，E蛋白在病毒受體結合、侵入和融合方面起到了關鍵的作用，是病毒的主要結構蛋白，具有較好的免疫原性，是檢測該病毒特異性抗體的理想靶抗原，也成為了宿主抗感染免疫的重要保護性抗原。因此，篩選新的E蛋白等位基因進行疫苗研發(fā)無疑具有重要的現(xiàn)實意義和市場開發(fā)價值。  發(fā)明內(nèi)容 本發(fā)明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒多克隆抗體及其制備方法，即以新的鴨坦布蘇病毒E蛋白基因作為免疫原產(chǎn)生的多克隆血清抗體，保護動物免受鴨坦布蘇病毒的感染。本發(fā)明多克隆抗體，是以氨基酸序列為SEQ ID NO 1的鴨坦布蘇病毒E蛋白為免疫原制備的。上述的多克隆抗體的制備方法，包括如下的步驟I)取鴨坦布蘇病毒E蛋白添加到弗氏完全佐劑中至濃度為lmg/ mL,混均后制成乳劑來免疫新西蘭大耳白兔；2)在第一次免疫后，每隔一周加強免疫一次，其中第二、三次免疫在乳劑中添加弗氏不完全佐劑，第四次注射抗原溶液；3)自第一次免疫后的第五周起取血，室溫下待血清完全分離，離心后的血清經(jīng)過純化后獲得為本發(fā)明制備的鴨坦布蘇病毒多克隆抗體。本發(fā)明制備的多克隆抗體用于預防鴨坦布蘇病毒病。本發(fā)明以純化的鴨坦布蘇病毒的重組E蛋白作為抗原注射新西蘭大耳白兔獲得多克隆血清，具有較好的免疫保護效果。將5日齡和35日齡的DTMUV陰性麻鴨注射多克隆血清后，對黃病毒的攻毒保護率分別達到100%和90%。用對開發(fā)敏感性高、特異性強的鴨坦布蘇病毒保護性抗體血清提供實驗基礎和較大的市場價值。 具體實施例方式下面結合具體實施方式 來進一步描述本發(fā)明，但本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的技術方案的情況下可以對本發(fā)明的技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明保護范圍內(nèi)。一、鴨坦布蘇病毒E基因的擴增將臨床分離疑似DTMUV的病料處理后接種SPF雞胚盲傳三代后，PCR擴增鴨坦布蘇病毒E基因全長，引物序列如下E-F: 5， AGAATTCATGTTCAGCTGTCTGGGGA， 3 (EcoR I)E-R: 5’ ACTCGAGTTAATTGACATTTACTGCCAGG ’3 (Xho I) 按以下參數(shù)在PCR儀上進行反應98 °C預變性30 S，然后以98 V 10 S、55 V15 s、72 °C I min進行25個循環(huán)。擴增產(chǎn)物進行測序后將E蛋白基因序列(SEQ ID NO :2)在NCBI上Blast比對，同源性最高為97%，表明擴增的樣品為新的病毒株。其翻譯的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。同時，對同一 DTMUV的病料感染的不同SPF雞胚，按照上述記載的條件進行擴增，擴增出的基因測序結果都一致，證明沒有在擴增過程中產(chǎn)生堿基的錯誤。將E蛋白基因的核苷酸(SEQ ID NO :2)5'端和3'端分別加上EcoR I和Xho I酶切位點，送基因公司進行全基因合成 二、基因工程蛋白表達載體的構建與工程菌的獲得1、E基因片段連接到pET_28a(+)載體上并轉化DH5a感受態(tài)細胞(I)合成的E基因與pET_28a (+)載體質(zhì)粒分別利用EcoR I和Xho I酶進行雙酶切。(2)酶切后目的片段的回收雙酶切產(chǎn)物通過1%瓊脂糖回收膠。(3)連接反應根據(jù)載體片段與插入片段摩爾數(shù)比為1: 2 10的原則，設計連接體系，16 °C連接過夜。(4)連接產(chǎn)物轉化E. coli DH5a感受態(tài)細胞，37 1孵箱培養(yǎng)過夜。(5)陽性轉化子的篩選與鑒定陽性克隆的測序由華大基因公司完成，將測序后的序列與標準合成序列進行核酸序列的Blast分析，與改造后的E蛋白基因的核苷酸(SEQ ID NO :2)完全一致。因此，將構建完成質(zhì)粒命名為pET-28a(+)-E。2. pET-28a(+)_E 質(zhì)粒轉化 E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞(l)pET-28a(+)_E 質(zhì)粒的提取。(2)pET-28a(+)_E 質(zhì)粒轉化 BL21(DE3)感受態(tài)細胞。(3)挑一株陽性克隆命名為BL21-pET-28a(+)_E菌株。三、發(fā)酵、純化與鴨坦布蘇病毒E蛋白制備(I) LB培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，含5g/L葡萄糖和5g/L MgSO4 7H20的LB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，補料為葡萄糖400g/L、蛋白胨24g/L、酵母提取物10 g/L, NaCl 5 g/L、MgSO4 7H20 5 g/L。(2)發(fā)酵過程挑取鑒定過的工程菌接種于含卡那霉素的濃度為50y g/ml的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)8小時，作為種子液。將種子液按2%接種量接種于發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)好各參數(shù)，37°C，200轉，溶氧控制在20%以上。發(fā)酵4小時后開始流加補料，發(fā)酵6小時后加入0. 3mmol/LIPTG進行誘導表達，表達后6小時發(fā)酵結束。(3)鎳柱純化、脫鹽(4)親和層析采用鎳離子金屬螯合層析柱，重組蛋白可以用含300mmol/L咪唑的洗脫液洗下來，純度達到90%以上(5)脫鹽收集的重組蛋白洗脫液放入透析袋，PBS液作為透析外液，透析脫鹽即得重組蛋白液。·四、多克隆血清的制備(I)動物選擇新西蘭大耳白兔兩只。( 2 )接種途徑皮下注射。(3)接種部位脊背，左右腳足墊，左右腹股溝。(4)佐劑使用弗氏完全佐劑(CFA)，弗氏不完全佐劑(IFA)為Sigma公司產(chǎn)品。(5)接種策略I)每只大耳白兔抗原免疫用量1.0 mg。取2. 5 mg E蛋白加弗氏完全佐劑2. 5 mL,順時針方向研磨直至形成“油包水”樣乳劑。2)固定大耳白兔，75 %乙醇消毒，分別在脊背，左右腳足墊，左右腹股溝皮下注射乳化液，注射量2 mL/只。3)每隔一周加強免疫一次，其中第二、三次加弗氏不完全佐劑，第四次注射抗原溶液。4)第五周起于兔耳緣靜脈取血將新西蘭大耳白兔輕輕放入固定架上，二甲苯涂于耳緣靜脈的上中部，用刀片傾斜45度在該處切出0. 2-0. 3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在結束之前出現(xiàn)凝固可用溫水輕擦切口處，再繼續(xù)收集。收集適量血液后可用消毒后的紗布輕擦患處，請按患處10-20秒確定血流停止方可結束。將血液在37°C恒溫箱中放置30分鐘，在4°C放置過夜。用藥鏟將血凝塊從管壁上拔落，將血液轉移至塑料離心管中，4°C 10，OOOg離心10分鐘，收集上清液即為抗血清。(6)抗體純化首先是準備BDV磷蛋白(P24) sepharose CL-4B親和柱。通常準備5mL或IOmLBDV磷蛋白(P24) sepharose CL-4B填料，在真空瓶中等體積的填料和TBS緩沖液混合，攪拌。抽真空約15min以除去填料中的氣泡，否則在柱中形成的氣泡影響柱子的容量和分離效果。將BDV磷蛋白(P24)s印harose CL-4B填料緩慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度為lmL/min-2mL/min,避免柱干,利用10倍于床體積并經(jīng)過預冷的TBS緩沖液平衡柱子。其次是制備抗血清，將抗血清放入冰水或4°C冰箱中緩慢解凍以避免蛋白質(zhì)的聚集，在蛋白質(zhì)解凍過程中出現(xiàn)的聚集可通過37°C預熱而溶解。加入固體疊氮化鈉至濃度為0. 05%，4°C15，OOOg離心5min，移出澄清的抗血清再經(jīng)過過濾器過濾除去多余的脂肪。將抗血清用TBS緩沖液以1:5的比例進行稀釋，再用過濾器進行過濾。以0. 5mL/min的速度將抗血清加入柱中，為保證抗血清與填料的結果，需連續(xù)上柱2次并保留上樣流出液。用TBS緩沖液清洗柱子至A (280nm) < O. 008后加pH 2. 7洗脫緩沖液，以O. 5mL/min的速度洗脫至所有蛋白均流下來。用已經(jīng)加入IOOuL中和緩沖液調(diào)至pH 7. 4以防止抗體的變性。在柱中加入IOmL pHl. 9洗脫緩沖溶液，按上述方法收集洗脫液至A (280nm) < 0.008。利用分光光度計測定各管中蛋白質(zhì)的含量。若蛋白濃度低于O. 5mg/mL可加入10%的甘油以便保存，將純化的抗體分裝后在2V _8°C保存。(7)用瓊脂糖雙擴法檢測特異性抗體的效價雙向免疫擴散結果顯示，在抗E蛋白抗血清稀釋度為1:32時，出現(xiàn)明顯沉淀線，兔抗E蛋白多克隆抗體效價為1:32。結論E蛋白可以使新西蘭大耳白兔產(chǎn)生多克隆抗體血清。 (8) Western印跡檢測血清特異性選取BL21 (DE3)菌為陰性對照，同時以純化后的E-His為陽性對照進行SDS-PAGE，電轉移至NC膜上，實施例3中制備的兔抗血清以1:5000稀釋為一抗，1:5000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG為二抗，檢測兔抗E-His血清的免疫反應性。結果表明純化的E-His蛋白可以與兔抗E-His血清能夠發(fā)生明顯的免疫反應，而BL21 (DE3)在相應分子量位置未見反應條帶出現(xiàn)，表明具有良好免疫反應性。五·克隆抗體血清的效果檢驗免疫血清的檢驗包括無菌檢驗、安全檢驗和效力檢驗。(I)無菌檢驗按現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》附錄進行無菌檢驗，結果無菌生長，符合規(guī)定。(2)安全檢驗用8日齡的DTMUV陰性麻鴨5只，各皮下注射多克隆血清O. 5mL;用35日齡的DTMUV陰性麻鴨5只，各皮下注射多克隆血清5ml，觀察10天，采食、飲水、健康狀況與對照組無明顯差異，全部健活。(3)效力檢驗選擇攻毒方法進行效力檢驗用20日齡DTMUV陰性麻鴨20只，10只各頸部皮下注射多克隆血清O. 25mL，另10只不接種作為對照，接種后14日，連同對照鴨10只，每只鴨各肌肉注射一個最小感染劑量鴨坦布蘇病毒液O. 5mL,觀察10日，注射血清組保護10只，對照組9只發(fā)病。六.免疫血清對不同日齡實驗動物的保護性檢驗(I)用5日齡DTMUV陰性麻鴨20只，10只各頸部皮下注射多克隆血清O. 25mL,另10只不接種作為對照，接種后14日，連同對照鴨10只，每只鴨各肌肉注射一個最小感染劑量鴨坦布蘇病毒液O. 5mL，觀察10日，注射血清組保護10只，對照組10只發(fā)病且其中2只死亡。(2)用35日齡DTMUV陰性麻鴨20只，10只各頸部皮下注射多克隆血清O. 25mL,另10只不接種作為對照，接種后14日，連同對照鴨10只，每只鴨各肌肉注射一個最小感染劑量鴨坦布蘇病毒液O. 5mL，觀察10日，注射血清組保護9只，對照組9只發(fā)病。同時，用臨床分離疑似DTMUV的病料，即篩選本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒E基因的材料做感染源，結果表明，已有的鴨坦布蘇病毒E制備的抗體免疫效果不理想，而本發(fā)明制備的多克隆抗體可以高效的進行免疫保護。 序列表 SEQUENCE LISTING <110> W島康地恩藥業(yè)股份有限公司 #島寶依特 物制藥 限公司 <120> Wtt布蘇病詩多克隆抗體及其制備方法 <160> 2 <170> Patentln version 3,5 <210>I <211>500 <212>PRT <213>DTMUV protein <400>I 權利要求 1.一種鴨坦布蘇病毒多克隆抗體，是以氨基酸序列為SEQ ID NO :1的鴨坦布蘇病毒E 蛋白為免疫原制備的。 2.權利要求1所述的多克隆抗體的制備方法，包括如下的步驟1)取鴨坦布蘇病毒E蛋白添加到弗氏完全佐劑中至濃度為lmg/mL,混均后制成乳劑來免疫新西蘭大耳白兔；2)在第一次免疫后，每隔一周加強免疫一次，其中第二、三次免疫在乳劑中添加弗氏不完全佐劑，第四次注射抗原溶液；3)自第一次免疫后的第五周起取血，室溫下待血清完全分離，離心后的血清經(jīng)過純化后獲得為本發(fā)明制備的鴨坦布蘇病毒多克隆抗體。 3.權利要求1所述的多克隆抗體用于預防鴨坦布蘇病毒病。 全文摘要 本發(fā)明涉及一種鴨坦布蘇病毒E蛋白多克隆血清及應用。本發(fā)明以純化的鴨坦布蘇病毒的重組E蛋白作為抗原注射新西蘭大耳白兔獲得多克隆血清，具有較好的免疫保護效果。將5日齡和35日齡的DTMUV陰性麻鴨注射多克隆血清后，對黃病毒的攻毒保護率分別達到100%和90%。用對開發(fā)敏感性高、特異性強的鴨坦布蘇病毒保護性抗體血清提供實驗基礎和較大的市場價值。 文檔編號A61P31/14GK102993300SQ201210480669 公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權日2012年11月22日 發(fā)明者魏波, 凌紅麗, 徐麗麗 申請人:青島寶依特生物制藥有限公司, 青島康地恩藥業(yè)股份有限公司