ICH的指南性文件Q2（R1）論述了在一個(gè)分析方法驗(yàn)證中需要進(jìn)行的驗(yàn)證項(xiàng)目，一方面主要是對(duì)分析方法驗(yàn)證的定義和相關(guān)術(shù)語(yǔ)進(jìn)行了解釋?zhuān)硪环矫嬷饕菍?duì)分析方法驗(yàn)證的方法學(xué)進(jìn)行了詳細(xì)闡述。

01

分析方法相關(guān)術(shù)語(yǔ)

2.1分析方法驗(yàn)證、確認(rèn)和轉(zhuǎn)移的要求

操作人員必須是經(jīng)過(guò)相關(guān)培訓(xùn)合格的分析員，所用分析儀器已經(jīng)通過(guò)確認(rèn)或校驗(yàn)，并在有效期內(nèi)；用的化學(xué)試劑必須符合試驗(yàn)要求的級(jí)別，并在有效期內(nèi)。實(shí)驗(yàn)必須依據(jù)預(yù)先確定和批準(zhǔn)的方案進(jìn)行，并有詳細(xì)記錄。試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)詳細(xì)記錄由明顯的實(shí)驗(yàn)室錯(cuò)誤導(dǎo)致的任何異常或失敗測(cè)試，若有不符按照偏差流程進(jìn)行調(diào)查。

2.2分析方法驗(yàn)證、確認(rèn)和轉(zhuǎn)移方案的起草、審核和批準(zhǔn)

分析方法驗(yàn)證、確認(rèn)和轉(zhuǎn)移試驗(yàn)方案包括但不限于以下內(nèi)容：詳細(xì)描述被驗(yàn)證、確認(rèn)或轉(zhuǎn)移的分析方法信息，明確需要進(jìn)行驗(yàn)證的項(xiàng)目及預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)，詳細(xì)描述各驗(yàn)證項(xiàng)目的驗(yàn)證步驟，關(guān)鍵配制過(guò)程包括樣品稱(chēng)量、定容、稀釋等試驗(yàn)過(guò)程的描述，進(jìn)樣要求、結(jié)果分析、數(shù)據(jù)要求，以及其他可能會(huì)影響到驗(yàn)證過(guò)程的信息。

2.3分析方法驗(yàn)證、確認(rèn)和轉(zhuǎn)移報(bào)告的起草、審核和批準(zhǔn)

分析方法驗(yàn)證報(bào)告應(yīng)提供完整的數(shù)據(jù)并對(duì)驗(yàn)證方案要求的所有驗(yàn)證項(xiàng)目進(jìn)行評(píng)估，出現(xiàn)的所有的偏差都必須記錄且在報(bào)告中加以討論。任何評(píng)估人員認(rèn)為所產(chǎn)生的偏差過(guò)大，整個(gè)驗(yàn)證程序就必須重做（如驗(yàn)證方案、驗(yàn)證活動(dòng)、驗(yàn)證報(bào)告）。分析方法驗(yàn)證報(bào)告一旦通過(guò)，所用測(cè)試方法的實(shí)驗(yàn)條件便可以使用。

2.4分析方法驗(yàn)證、確認(rèn)和轉(zhuǎn)移方案及報(bào)告的保存

最終的方法驗(yàn)證總文件包（包括方案、報(bào)告和試驗(yàn)記錄等）均應(yīng)由QA保管。

2.5需驗(yàn)證的檢測(cè)項(xiàng)目

根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的設(shè)定目的和驗(yàn)證內(nèi)容的不同，可將需要驗(yàn)證的檢測(cè)項(xiàng)目分為鑒別、雜質(zhì)檢查（限度試驗(yàn)或定量試驗(yàn)）、定量測(cè)定（含量測(cè)定）、微生物學(xué)檢查（微生物限度檢查、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查等）、其他特定項(xiàng)目檢測(cè)。

分析方法驗(yàn)證包括：專(zhuān)屬性、線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度、檢測(cè)限、定量限、耐用性、溶液穩(wěn)定性、系統(tǒng)適用性等。

3.1專(zhuān)屬性

一般情況下，鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定方法中均應(yīng)考察其專(zhuān)屬性。如采用的方法不夠?qū)?，?yīng)采用多個(gè)方法予以補(bǔ)充。

3.1.1鑒別反應(yīng)的專(zhuān)屬性驗(yàn)證

鑒別試驗(yàn)應(yīng)確證被分析物符合其特征。專(zhuān)屬性試驗(yàn)要求證明能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)類(lèi)似化合物區(qū)分，需確證含被分析物的樣品呈正反應(yīng)（可與已知對(duì)照物比較），而不含被測(cè)成分的樣品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，應(yīng)均呈負(fù)反應(yīng)。

3.1.2雜質(zhì)檢查的專(zhuān)屬性驗(yàn)證

作為純度檢查，所采用的分析方法應(yīng)確?？蓹z出被分析物中雜質(zhì)的含量，如有關(guān)物質(zhì)、重金屬、殘留溶劑等。因此雜質(zhì)檢查要求分析方法有一定的專(zhuān)屬性。在雜質(zhì)可獲得的情況下，可向供試品中加入一定量的雜質(zhì)，證明雜質(zhì)之間能得到分離和檢出，并具適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確度和精密度。

在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，專(zhuān)屬性可通過(guò)與另一種已證明是合適的、分離或檢測(cè)原理不同、或具較強(qiáng)分辨能力的方法進(jìn)行結(jié)果比較來(lái)確定，或?qū)⒐┰嚻酚脧?qiáng)光照射，高溫，高濕，酸、堿、水解及氧化的方法進(jìn)行破壞，已研究可能的降解產(chǎn)物和降解途徑，比較破壞前后檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)和量。必要時(shí)可采二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)，進(jìn)行色譜峰純度檢查，一般情況下峰純度應(yīng)>990。破壞實(shí)驗(yàn)按已批準(zhǔn)的方案執(zhí)行，各個(gè)破壞條件如下：

• 光照降解：將樣品通過(guò)適宜的厚度平鋪于稱(chēng)量瓶，置于光強(qiáng)度（4500lx±500lx）處的光源處，并每隔一段時(shí)間取樣進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)樣品約5%~10%被破壞時(shí)，可終止反應(yīng)或根據(jù)已批準(zhǔn)的方案執(zhí)行。

• 高溫固體降解：將樣品通過(guò)適宜的厚度平鋪于稱(chēng)量瓶，一般置于105℃（或在樣品的熔點(diǎn)或分解點(diǎn)附近選擇一個(gè)適合的溫度點(diǎn)）的鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)一段時(shí)間，并每隔一段時(shí)間取樣進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)樣品約5%~10%被破壞時(shí)，可終止反應(yīng)或根據(jù)已批準(zhǔn)的方案執(zhí)行。

• 高濕降解：將樣品通過(guò)適宜的厚度平鋪于稱(chēng)量瓶，控制濕度75%或92.5%考察一段時(shí)間。并每隔一段時(shí)間取樣進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)樣品約5%~10%被破壞時(shí)，可終止反應(yīng)或根據(jù)已批準(zhǔn)的方案執(zhí)行。

• 酸降解：將樣品溶解后，采用一定濃度的鹽酸溶液，在一定的溫度條件下放置一段時(shí)間，每隔一段時(shí)間取出部分樣品，用相同濃度和體積的堿液進(jìn)行中和，用經(jīng)驗(yàn)證的色譜方法進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)樣品約5%~10%被破壞時(shí)，可終止反應(yīng)或根據(jù)已批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

• 堿降解：將樣品溶解后，采用一定濃度的氫氧化鈉溶液，在一定的溫度條件下放置一段時(shí)間，每隔一段時(shí)間取出部分樣品，用相同濃度和體積的酸性溶液進(jìn)行中和，用經(jīng)驗(yàn)證的色譜方法進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)樣品約5%~10%被破壞時(shí)，可終止反應(yīng)或根據(jù)已批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

• 氧化降解：將樣品溶解后，采用一定濃度的H2O2，在一定的溫度條件下放置一定的時(shí)間，每隔一段時(shí)間取出部分樣品，用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的色譜方法進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)樣品約5%~10%被破壞時(shí)，可終止反應(yīng)或根據(jù)已批準(zhǔn)的方案執(zhí)行。

• 高溫液體降解：將樣品溶解后，在一定的溫度條件下水浴破壞一段時(shí)間，每隔一段時(shí)間取出部分樣品進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)約5%~10%的樣品被破壞后可終止反應(yīng)或根據(jù)已批準(zhǔn)的方案執(zhí)行。

在各降解條件下，主峰降低應(yīng)在5%~10%以內(nèi)；如果主峰降低超過(guò)10%，則應(yīng)減少破壞或/和破壞溶液的濃度重新降解試驗(yàn)；若果樣品在較強(qiáng)的條件下破壞后，仍然穩(wěn)定，則停止試驗(yàn)，判斷該條件對(duì)樣品無(wú)明顯影響；主峰峰純度>990；質(zhì)量平衡率評(píng)價(jià)指標(biāo)：質(zhì)量平衡率在90%~110%之間可認(rèn)為此分析方法對(duì)雜質(zhì)檢出能力較好 。

3.1.3含量測(cè)定的專(zhuān)屬性驗(yàn)證

含量測(cè)定目的是得到供試品中被分析物的含量的準(zhǔn)確結(jié)果。

在雜質(zhì)可獲得的情況下，對(duì)于主成分含量測(cè)定可在供試品中加入雜質(zhì)，考察測(cè)定結(jié)果是否受干擾，并與未加雜質(zhì)的試樣比較測(cè)定結(jié)果。在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可通過(guò)與另一種具有較強(qiáng)分辨能力的方法（藥典方法，經(jīng)驗(yàn)證的獨(dú)立方法）比對(duì)兩種方法測(cè)定的結(jié)果。也可采用破壞性試驗(yàn)（強(qiáng)光照射，高溫，高濕，酸，堿，水解及氧化），其破壞條件同雜質(zhì)檢查的專(zhuān)屬性驗(yàn)證項(xiàng)下，得到含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣，用兩種方法進(jìn)行含量測(cè)定比較測(cè)定結(jié)果。必要時(shí)進(jìn)行色譜峰純度檢查，證明含量測(cè)定成分的色譜峰中不包含其他成分。

3.1.4殘留溶劑測(cè)定的專(zhuān)屬性驗(yàn)證

空白溶液不干擾可能存在溶劑的出峰，對(duì)照品溶液及加標(biāo)溶液中每個(gè)峰的分離度應(yīng)不小于1.5，則確認(rèn)本方法能夠符合預(yù)期的使用要求。

3.2線性

線性是定量測(cè)定的基礎(chǔ)，涉及定量測(cè)定的項(xiàng)目，如雜質(zhì)定量試驗(yàn)、含量測(cè)定等均需驗(yàn)證線性。

應(yīng)在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系?？捎靡毁A備液經(jīng)精密稀釋或分別精密稱(chēng)樣，制備一系列被測(cè)物質(zhì)濃度進(jìn)行測(cè)定，至少制備5個(gè)濃度，每個(gè)濃度至少進(jìn)樣2次，以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)的平均值和被測(cè)物濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算。相關(guān)稀釋r越接近1.000，表明越呈線性。

接受標(biāo)準(zhǔn)：除另有規(guī)定外相關(guān)系數(shù)r應(yīng)>0.999，含量測(cè)定截距的絕對(duì)值≤100%濃度峰面積的2%；有關(guān)物質(zhì)及殘留溶劑截距應(yīng)≤允許限度濃度峰面積的25%。

表1線性驗(yàn)證需涵蓋的最低濃度范圍

3.2.1相對(duì)校正因子

參考線性項(xiàng)下各雜質(zhì)與主成分的線性回歸方程的斜率，采取以下公式計(jì)算各雜質(zhì)相對(duì)主成分的相對(duì)校正因子f：

式中：

標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：f>1.1或<0.9時(shí)，應(yīng)帶入相對(duì)校正因子對(duì)結(jié)果校正；若結(jié)果是被高估的，也可不帶入相對(duì)校正因子對(duì)結(jié)果校正；0.9≤f≤1.1，無(wú)需帶入相對(duì)校正因子對(duì)結(jié)果校正（即f以1.0計(jì)）

3.2.2線性范圍

范圍通常用于分析方法的測(cè)試結(jié)果相同的單位（如百分濃度）表達(dá)。涉及到定量檢測(cè)的檢測(cè)項(xiàng)目均需要對(duì)范圍進(jìn)行驗(yàn)證，如含量測(cè)定、雜質(zhì)定量試驗(yàn)等。范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精度結(jié)果和要求確定。要求見(jiàn)線性內(nèi)容章節(jié)。