ctDNA 液體活檢目前是精準(zhǔn)腫瘤學(xué)應(yīng)用研究中的熱點(diǎn)，主要通過檢測血液中游離的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）或者循環(huán)腫瘤DNA片段（ctDNA）等物質(zhì)來對癌癥疾病做出診斷。其原理在于腫瘤細(xì)胞在經(jīng)歷凋亡或壞死等階段時(shí)會(huì)釋放DNA片段進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)中，而這些DNA片段往往包含了腫瘤的體細(xì)胞突變，同時(shí)其豐度與腫瘤的大小和階段緊密相關(guān)。

相較于傳統(tǒng)的腫瘤組織活檢技術(shù)，ctDNA 液體活檢具備更多優(yōu)點(diǎn)，比如采樣速度快，價(jià)格便宜，侵入性極小，同時(shí)能夠追蹤腫瘤的一系列發(fā)展變化。更重要的是，腫瘤組織活檢在事先不知道是腫瘤的情況下是無法進(jìn)行的，而ctDNA液體活檢卻具備識別未知病變的能力，它還可以檢測微小殘余病灶（MRD）來檢測腫瘤治療情況，甚至可以在健康人群中進(jìn)行癌癥篩查。

近日，由美國FDA牽頭、美國阿肯色醫(yī)學(xué)科學(xué)大學(xué)研究組、美國國家毒理學(xué)研究中心研究組、SEQC2 Oncopanel Sequencing Working Group 等研究組組成的聯(lián)合團(tuán)隊(duì)在 Nature 子刊Nature Biotechnology發(fā)表了題為 Evaluating the analytical validity of circulating tumor DNA sequencing assays for precision oncology 的研究。

文中提到，隨著ctDNA液體活檢的快速發(fā)展，這一技術(shù)也面臨著重大挑戰(zhàn)，因此，研究團(tuán)隊(duì)建立了一個(gè)跨平臺、多實(shí)驗(yàn)室參與的技術(shù)平臺，借此對ctDNA液體活檢技術(shù)的有效性進(jìn)行綜合評估，并為該技術(shù)的未來發(fā)展提出了建設(shè)性的改進(jìn)建議。

研究提到，雖然ctDNA液體活檢正在迅速運(yùn)用于精準(zhǔn)腫瘤學(xué)中，但是其短板更需要引起注意。比如，液體活檢需要通過檢測游離DNA（cell-free DNA）進(jìn)行診斷，但是如果游離DNA片段過小，將對體細(xì)胞突變檢測產(chǎn)生更高的挑戰(zhàn)，其準(zhǔn)確性或許會(huì)大打折扣。此外，ctDNA檢測也會(huì)受到大量實(shí)驗(yàn)變量的影響，這些變量可能會(huì)導(dǎo)致測序錯(cuò)誤，例如，游離DNA片段過小將抑制靶向富集，影響復(fù)雜位點(diǎn)或突變的解析。

由此，研究團(tuán)隊(duì)采用模擬與合成對照試驗(yàn)，并加入了對人造人類ctDNA作為參比物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室能力對比驗(yàn)證，以測量ctDNA測序工作流程中每個(gè)步驟變量所產(chǎn)生的影響。他們首先分別通過操作模擬試驗(yàn)與合成試驗(yàn)，確定會(huì)造成ctDNA檢測偏差的因素。在模擬試驗(yàn)中，研究人員建立了包含有155個(gè)癌癥基因的模擬庫，結(jié)果顯示，ctDNA在檢測較短的DNA片段深度時(shí)，其檢測到突變的敏感度降低，這將阻礙顯著基因例如RAS基因家族的檢測效果，這表明，即使沒有試驗(yàn)變量的影響，基因組本身就將對ctDNA檢測的效果產(chǎn)生很大影響。

而在合成對照試驗(yàn)中，研究人員使用了被稱為“亮片”的合成DNA來評估ctDNA檢測突變的效果。“亮片”是一種人工合成的DNA序列，它能夠模擬人類的自然基因和突變。結(jié)果顯示，腫瘤基因變異頻率對于ctDNA檢測的影響大于變異類型，同時(shí)，腫瘤異質(zhì)性也是重要的影響因素之一，ctDNA檢測靈敏度在外顯子的邊緣區(qū)域、高/低GC含量的區(qū)域以及低序列復(fù)雜區(qū)域出現(xiàn)了顯著地降低。這些結(jié)論也顯示，在患者治療期間，準(zhǔn)確識別低頻ctDNA突變的豐度變化存在著較大困難。

接下來，研究團(tuán)隊(duì)集合了羅氏、因美納、IDT、燃石醫(yī)學(xué)以及賽默飛5家在ctDNA領(lǐng)域擁有領(lǐng)先技術(shù)的企業(yè)，對它們的液體活檢產(chǎn)品展開了測試與評估。研究人員先從十種不同的人類癌癥細(xì)胞系中，提取了相同豐度的基因組DNA，將它們匯集在一起以創(chuàng)建一個(gè)模擬癌癥樣本，并將它們送往包括美國、英國、中國、澳大利亞在內(nèi)的12家臨床研究機(jī)構(gòu)中展開測試與評估。每個(gè)ctDNA檢測會(huì)在2-3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室為每個(gè)測試樣本生成4個(gè)技術(shù)復(fù)制品，每個(gè)測序樣本由相關(guān)的ctDNA檢測產(chǎn)品供應(yīng)商進(jìn)行分析，最終總共進(jìn)行了360次ctDNA檢測分析。

在這次評估中，研究人員對ctDNA液體活檢的覆蓋深度與異質(zhì)性、靈敏度、準(zhǔn)確性、重復(fù)性、游離DNA輸入量與抽血帶來的影響等多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆治雠c研究。結(jié)合每款產(chǎn)品最終的測序結(jié)果與對比分析，研究人員發(fā)現(xiàn)：

1.所有參與其中的液體活檢產(chǎn)品都能以極高的靈敏度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性檢測到約0.5%以上變異等位基因頻率（VAF）的突變，但是當(dāng)VAF低于0.5%時(shí)，其變異檢測則變得不再可靠，對于ctDNA變異低于0.5%VAF的靈敏度檢測將成為液體活檢中的主要挑戰(zhàn)之一；

2.游離DNA的輸入量是一個(gè)關(guān)鍵變量，隨著其輸入量的增加，檢測片段時(shí)的深度、靈敏度和重復(fù)性都有所提高；

3.一項(xiàng)ctDNA檢測手段的特性決定了其在研究和臨床腫瘤學(xué)中的潛在適用性，也就是說不同的檢測方法適用于完成不同的檢測目標(biāo)。例如，如果ctDNA片段在血液循環(huán)中的豐度降低，高靈敏度與精準(zhǔn)度的產(chǎn)品將更適用于檢測早期與晚期腫瘤的分子表征分析；

4.利用ctDNA測序技術(shù)檢測和監(jiān)測術(shù)后微小殘余病灶（MRD）將成為一種很有潛力的應(yīng)用，但是，這項(xiàng)應(yīng)用需要對VAF在0.1%-0.01%的檢測具有高靈敏度，這樣才能可靠預(yù)測疾病復(fù)發(fā)概率。

綜上所述，這項(xiàng)研究給出的結(jié)論是，目前來看，改善對低于0.5%VAF突變的檢測將成為ctDNA液體活檢的重中之重。希望這項(xiàng)技術(shù)在未來能夠突破這一局限，為腫瘤患者帶來更多的福音！(生物谷Bioon.com）