慢性肝臟疾病是一個(gè)全球性健康問(wèn)題，每年因慢性肝臟疾病死亡的人數(shù)高達(dá)200多萬(wàn)。

肝纖維化是由于各種慢性肝損傷導(dǎo)致肝組織中細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積和纖維瘢痕形成的一種病理過(guò)程。當(dāng)損傷持續(xù)時(shí)纖維化會(huì)發(fā)展成肝硬化和肝癌，最后可能危及生命。

越來(lái)越多的研究表明肝纖維化是一個(gè)可逆過(guò)程，只要肝臟不處于晚期肝硬化階段，消除誘發(fā)纖維化的損害因素就有助于肝纖維化的消退。然而，目前在肝纖維化方面尚無(wú)有效的診斷和治療方案，全球每年仍然有2%～3%的纖維化患者發(fā)展為肝硬化，而死于肝硬化、肝癌等疾病的人數(shù)高達(dá)15～30萬(wàn)人，約占全球肝病死亡人數(shù)的45%。因此，現(xiàn)迫切需要開(kāi)發(fā)一種安全、有效、廉價(jià)的藥物用于肝纖維化的臨床治療。

近年來(lái)，中醫(yī)藥在防治肝纖維化方面?zhèn)涫荜P(guān)注，并取得了很大進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，中藥配方可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，保護(hù)肝細(xì)胞，改善肝臟微循環(huán)。這些中藥配方中的活性成分（如：類(lèi)黃酮，皂角苷，酸，酚和生物堿等）被認(rèn)為是發(fā)現(xiàn)治療肝損傷藥物的潛在來(lái)源。

陳皮酵素是由新會(huì)陳皮、新會(huì)柑全果和多種中藥材發(fā)酵而來(lái)。研究人員檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陳皮酵素中富含總黃酮、多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等活性成分。黃酮類(lèi)化合物因其具有抗腫瘤、抗炎、心血管保護(hù)等生物活性而備受關(guān)注。近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)化合物也同時(shí)具有保肝、抗肝纖維化等作用。此外，多糖也因其生物活性也被廣泛研究，有研究發(fā)現(xiàn)多糖具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用。

陳皮酵素中的其他成分如氨基酸和蛋白質(zhì)也是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。結(jié)合上述研究結(jié)論我們推斷陳皮酵素可能具有抗肝纖維化和肝臟保護(hù)等潛力，但陳皮酵素能否抑制肝纖維化尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)陳皮酵素的體內(nèi)抗肝纖維化作用進(jìn)行了探究。

CCl₄、水合氯醛和生理鹽水；橄欖油；陳皮酵素；血清肝功能檢測(cè)試劑盒；蘇木精-伊紅染色試劑盒；天狼星紅染色試劑盒。

119只5周齡的雄性C57BL/6小鼠（廣州賽柏諾生物）。小鼠飼養(yǎng)在適宜的環(huán)境溫度和濕度下，并以滅菌后的水和小鼠飼料飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。所有小鼠隨機(jī)分為模型組（n=49）、實(shí)驗(yàn)組（n=56）、對(duì)照組（n=7）和陳皮酵素組（n=7）。模型組灌胃40%CCl₄橄欖油溶液（3×0.1mL/周），共8周；實(shí)驗(yàn)組灌胃40%CCl₄橄欖油溶液（3×0.1mL/周）和陳皮酵素（0.26mL/d），共8周；對(duì)照組和陳皮酵素組分別給予橄欖油（3×0.1mL/周）和陳皮酵素(0.26mL/d)，共8周。實(shí)驗(yàn)組每周末次灌胃36h后處死7只小鼠，模型組每周末次灌胃48h后處死7只小鼠，對(duì)照組和陳皮酵素組小鼠第8周最后一次給藥48h后全部處死。小鼠處死后立即采集肝臟標(biāo)本和血清。所有動(dòng)物處理和程序均經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

取小鼠肝臟左葉并用10%福爾馬林緩沖液固定。石蠟包埋肝臟組織，包埋組織經(jīng)連續(xù)切片（厚度4μm）、攤片、烤片、烘片，常規(guī)二甲苯脫蠟，醇洗和水洗后用H&E和天狼星紅染色。觀察細(xì)胞變性、壞死等形態(tài)學(xué)改變。根據(jù)天狼星紅染色顯微照片評(píng)價(jià)Ishak纖維化評(píng)分。

用全自動(dòng)生化分析儀（Beckman Coulter AU680;Beckman Coulter Corporation，美國(guó)）檢測(cè)血清甘氨酸（CG）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）水平。

利用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；計(jì)數(shù)資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)（MannWhitney檢驗(yàn)），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

模型組血清CG水平呈上升趨勢(shì)，而實(shí)驗(yàn)組血清CG水平保持穩(wěn)定。每周實(shí)驗(yàn)組血清CG水平低于模型組，尤其是在第7周后，兩組之間的CG水平差異逐漸增大。實(shí)驗(yàn)組每周血清ALT和AST水平均低于模型組（P<0.05）。從第4周開(kāi)始，模型組血清ALT、AST水平逐漸升高，而兩組血清ALT、AST水平的差異此后也越來(lái)越大。實(shí)驗(yàn)組每周ALP水平也低于模型組。從第4周開(kāi)始，兩組的血清ALP水平差異也越來(lái)越大（圖1）。

圖1 陳皮酵素對(duì)CCl4小鼠模型肝功能的影響

對(duì)照組和陳皮酵素組小鼠肝組織切片未見(jiàn)損傷，而只灌胃CCl₄的小鼠肝損傷和纖維化程度逐漸加深，表現(xiàn)為匯管區(qū)明顯的脂肪變性、壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。但給予陳皮酵素的實(shí)驗(yàn)組炎癥程度較模型組減輕，表現(xiàn)為空泡化和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少（圖2A）。此外，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量基本穩(wěn)定（圖2B），模型組小鼠體質(zhì)量明顯減輕（P<0.05）。但給予陳皮酵素后小鼠體質(zhì)量下降程度有所減輕。

圖2 陳皮酵素對(duì)CCl4小鼠模型組織病理學(xué)和體質(zhì)量的影響

結(jié)果顯示，對(duì)照組和陳皮酵素組未見(jiàn)膠原沉積（圖3A）。模型組在第1周就出現(xiàn)了膠原沉積，形成纖維隔膜。在接下來(lái)的幾周內(nèi)，纖維隔膜增多，并開(kāi)始出現(xiàn)纖維橋連和結(jié)節(jié)。然而，給予陳皮酵素后小鼠的膠原沉積相對(duì)減少。尤其在前5周，實(shí)驗(yàn)組膠原沉積現(xiàn)象較模型組明顯改善。第5周后，實(shí)驗(yàn)組肝纖維化程度逐漸接近持續(xù)灌胃CCl₄的模型組，此時(shí)，肝損傷程度開(kāi)始不可逆轉(zhuǎn)。根據(jù)染色的組織切片中纖維隔膜、纖維橋連和結(jié)節(jié)的發(fā)展程度，對(duì)不同周的肝組織進(jìn)行Ishak評(píng)分，實(shí)驗(yàn)組的Ishak評(píng)分低于模型組（圖3B）。前5周兩組評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但后6～8周的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖3 陳皮酵素對(duì)CCl₄小鼠模型肝纖維化的影響

目前關(guān)于肝纖維化的造模方法有很多種，其中CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化模型是反映慢性肝纖維化的最佳模型，也是最接近人類(lèi)的模型。CCl₄毒性可導(dǎo)致肝損傷和肝纖維化，肝損傷可導(dǎo)致血清和肝組織中ALT和AST水平升高。

本結(jié)果也顯示，CCl₄處理組小鼠血清中ALT和AST水平升高，這表明小鼠肝臟受到損傷，CCl₄具有明顯的致炎毒性。我們通過(guò)組織病理學(xué)檢查、肝纖維化分級(jí)評(píng)價(jià)CCl₄誘導(dǎo)肝纖維化的毒性作用，結(jié)果顯示CCl₄處理組小鼠肝組織中有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原沉積現(xiàn)象，這表明本研究成功構(gòu)建了CCl₄誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型。

隨后我們?cè)诖四Ｐ突A(chǔ)上探究了陳皮酵素的抗肝纖維化作用，給予陳皮酵素后肝功能指標(biāo)水平降低，這顯示出陳皮酵素的保肝作用。組織病理學(xué)結(jié)果顯示局部炎癥和膠原沉積程度減輕，尤其是前5周肝纖維化程度明顯改善（P<0.05），但是第5周后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的肝纖維化程度越來(lái)越接近，這說(shuō)明陳皮酵素可減輕CCl₄誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化的程度，并且早期應(yīng)用陳皮酵素可以延緩肝纖維化的發(fā)展。此外，灌胃CCl₄的小鼠體質(zhì)量明顯減輕，這可能是由于肝功能受損導(dǎo)致食欲下降所致，給予陳皮酵素后小鼠體質(zhì)量下降程度有所減輕。

研究表明果蔬類(lèi)酵素具有抗腫瘤、改善胃腸道菌群的多樣性并減少內(nèi)臟器官的氧化損傷等藥理作用，但市面上這些酵素大都是由水果或蔬菜發(fā)酵而來(lái)，使用中藥材發(fā)酵的產(chǎn)品很少。

陳皮酵素由陳皮、新會(huì)柑橘和人參、菊花等中藥材為原料經(jīng)自然發(fā)酵和現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合發(fā)酵而成，充分保留了新會(huì)柑和這些中藥材中的活性成分。此外，酵素在抗肝纖維化方面的研究也尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究探討陳皮酵素對(duì)CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的影響。目前，木瓜發(fā)酵液在臨床上已用作作為調(diào)節(jié)內(nèi)分泌紊亂和抗氧化活性，以及改善免疫和抗炎反應(yīng)的功能性食品，本研究顯示陳皮酵素也同樣具有在臨床上用作抗肝纖維化功能性食品的潛力。

綜上所述，給予陳皮酵素的小鼠肝纖維化程度明顯減輕，且早期應(yīng)用陳皮酵素更有效，可以推斷陳皮酵素可以抑制早期肝纖維化。但是，陳皮酵素抑制肝纖維化的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。