易點評

 循環(huán)外泌體RNA（尤其是miRNA）已經(jīng)成為檢測早期癌癥的最具前景的生物標志物之一。本研究即是一例循環(huán)外泌體作為宮頸癌早期篩查潛在標志物的開發(fā)案例。

背景

宮頸癌(CC)是20至39歲女性患癌癥致死的第二大病因。其發(fā)病率和死亡率分別為98.9/10萬和30.5/10萬，且在中國有上升趨勢。宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的CC篩查對于識別高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、防止其發(fā)展為浸潤性癌具有重要意義。篩查方式一般為巴氏涂片(巴氏涂片)和Thinprep細胞學試驗(TCT)，通過篩查可以極大地降低宮頸癌的發(fā)病率，并提高宮頸癌的5年存活率。然而，巴氏涂片和TCT的診斷率仍然較低，這是由于早期篩查并不是在中國所有的地區(qū)都得到了普及，特別是在農(nóng)村地區(qū)，大多數(shù)女性在出現(xiàn)陰道異常出血、白帶、腹痛等癥狀時才會進行檢查。

外泌體是存在于所有體液中的30-150 nm的微小囊泡，是精準醫(yī)學液體活檢的關(guān)鍵指標之一。外泌體可以提供豐富的遺傳物質(zhì)，包括DNA片段、mRNA、長非編碼RNA、小RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，它們與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。與長非編碼RNA、無細胞DNA的異質(zhì)性突變位點和mRNA的不穩(wěn)定特性等復雜機制相比，外泌體miRNA穩(wěn)定且相對不可降解，檢測方法相對成熟，并且最近的研究表明，外泌體miRNA有可能成為癌癥篩查、診斷和監(jiān)測的有效生物標志物。例如，5-miRNA可以區(qū)分惰性前列腺癌和侵襲性前列腺癌。miR-122、miR-192、miR-17-5p和miR-25-3p分別在不同的腫瘤組織中富集。一些來自血漿或血清的miRNA已經(jīng)顯示出它們作為宮頸鱗癌(SCC)手術(shù)前后和早期發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌的非侵襲性生物標志物的潛力。

在本研究中，作者對癌癥生物標記物開展了大規(guī)模的血漿miRNA研究。對121例健康志愿者、宮頸癌患者和癌前病變患者的血漿樣本進行了外泌體miRNA測序。然后用qRT-PCR驗證了46例宮頸癌及其癌旁組織中差異表達的miRNA(DEmiRs)。此外，使用ddPCR進一步驗證了其中兩個DEmiRs(miR-30d-5p和let-7d-3p)在203份獨立的血漿樣本中的差異性，證實了這兩種外泌體miRNA的聯(lián)合應(yīng)用在宮頸癌的早期檢測中是有效且具有前景的。

結(jié)果

外泌體中差異表達miRNA的鑒定

首先，對檢測到的所有DEmiRs進行主成分分析(PCA)和聚類分析，并將血漿樣本按照相似miRNA表達模式進行分配(圖1)。作者發(fā)現(xiàn)，CIN II-III和CC組樣本具有共同的miRNA表達情況。此外，作者還比較了健康受試者和CINⅠ受試者miRNA的表達，但沒有發(fā)現(xiàn)DEmiRs(FDR>0.05)。這些結(jié)果印證了分組策略，即將CIN II-III、ACC和SCC患者合并為一組，而將健康受試者和CIN I患者合并為另一組。最后，CIN I-與CIN II+組比較發(fā)現(xiàn)了37個DEmiR(FDR<0.01)，其中9個表達上調(diào)，28個表達下調(diào)。

外泌體miRNA鑒別CIN I-和CIN II+患者的診斷準確性

接下來，使用隨機森林算法從121個血漿外泌體測序樣本的37個DEmiR中選擇一組miRNA，確定了具有8個miRNA(let-7a-3p、let-7d-3p、miR-30d-5p、miR-144-5p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR215-5p和miR-4443)的組合，它們是臨床診斷中鑒別CIN I-與CIN II+最有效的預測因子。這八個miRNA的等級聚類表明，只有兩個CIN II+患者被錯誤地歸入CIN I-組(圖1)。ROC分析進一步評估了miRNA標記區(qū)分CIN II+和CIN I-受試者的敏感性和特異性，統(tǒng)計出AUC值為0.992(圖1)。綜上所述，新發(fā)現(xiàn)的8個miRNA對CIN I-和CIN II+有很高的預測性。

miRNA的途徑富集分析

為了進一步了解這些miRNA在CC中的分子功能，我們對這些miRNA進行了富集分析。在8個DEmiRs的富集途徑中，有25個顯著相關(guān)通路(FDR<0.01)，其中5個是與腫瘤相關(guān)的通路，如細胞周期、p53信號通路、AMPK信號通路等，值得注意的是，最主要的靶向途徑是病毒致癌，這與HPV引起的CC是一致的。此外，卵母細胞減數(shù)分裂和雌激素信號通路也很重要。并且，miR-30d-5p、miR-182-5p和miR-183-5p同時調(diào)控RAC1、IGF1R、NRAS、TP53和CCND1基因，這些基因參與了大部分上述重要途徑。這些結(jié)果表明，這8個外泌體miRNA不僅可以作為潛在的診斷生物標志物，并且由于它們在功能上參與了CC的發(fā)生和發(fā)展，還可以被當作潛在的抗癌藥物靶點。

圖1

qRT-PCR驗證候選標志物miRNA的有效性

作者使用qRT-PCR評估了46例CC患者的癌組織和癌旁組織中用于區(qū)分CIN I-和CIN II+的最佳小組中的8個DEmiRs。其中5個miRNA(let-7a-3p、let-7d-3p、miR-30d-5p、miR-183-5p和miR-182-5p)在血漿外泌體中表現(xiàn)出一致的變化趨勢，3個(let-7a-3p、let-7d-3p和miR-30d-5p)在癌組織和癌旁組織中的表達存在顯著差異。然而，8個miRNA中的另外3個(miR-215-5p、miR-144-5p和miR-4443)在組織中與血漿外泌體中沒有出現(xiàn)明顯變化。

ddPCR在獨立血漿樣本中驗證miRNA的有效性

血漿外泌體測序let-7d-3p和miR-30d-5p的表達組合，在121個訓練樣本中AUC值為0.922。而在203個測試樣本中，這兩個DEmiR的AUC值為0.828(圖2)。此外，在203份有效樣本中，基于細胞學測試的樣本的AUC值為0.766，而基于miRNA的AUC值增加到了0.834，并且在基于細胞學測試的模型中進一步整合這兩個miRNA得到了更高的AUC值0.887(圖2)。

外泌體和組織間miRNA表達差異的研究

為了確定miRNA的空間分布和表達水平，作者還用ddPCR方法檢測了7個miRNA(miR-320a、miR-128-3p、miR-129-5p、let-7d-3p、let-7i-5p、miR-30d-5p和miR-30a-5p)在CC患者血漿外泌體以及癌旁正常組織中的表達水平。結(jié)果顯示在組織和外泌體之間存在不同的表達情況。這些miRNA在組織中的比例分別為57.5%、0.5%、2.9%、5.7%、9.1%、10.3%和13.9%，在外泌體中分別為23.8%、22.8%、5.3%、7.5%、4.5%、18.2%和17.9%。外泌體與組織間miRNA表達豐度的Spearman相關(guān)系數(shù)僅為0.321(P=0.498)，這表明外泌體miRNA可能是由腫瘤細胞選擇性分泌的。

圖2

結(jié)論

本研究是一項癌癥生物標記物的大型血漿miRNA研究。鑒定出了外泌體miR-30d-5p和let-7d-3p是宮頸癌及其癌前病變非侵襲性篩查有前景的診斷生物標志物。在臨床上，抽血比TCT或巴氏涂片檢查更加便捷，并且陰道或?qū)m頸感染的風險更低。同時，它還可以納入常規(guī)血液檢測，這大大提高了臨床的檢驗效率。此外，血漿外泌體中的miRNA是穩(wěn)定的，對物理降解具有抵抗力，這是它們能夠成為宮頸癌篩查最有前途的診斷生物標志物的原因之一。然而，在應(yīng)用到臨床診斷之前，還需要使用大樣本量進行進一步驗證。對這些miRNA的功能研究為宮頸癌進展過程中的機制和生理相關(guān)性提供了新的見解。

精準醫(yī)學：外泌體let-7d-3p和miR-30d-5p作為宮頸癌及其癌前病變無創(chuàng)篩查的診斷標志物｜早期篩查