原名：Amino acid and lipid metabolism in post-gestational diabetes and progression to type 2 diabetes: A metabolic profiling study

譯名：妊娠期糖尿病及其發(fā)展為2型糖尿病的氨基酸和脂質(zhì)代謝：代謝譜研究

期刊：PLoS Medicine

IF：11.048

發(fā)表時間：2020.5.20

通訊作者：Michael B. Wheeler

通訊作者單位：多倫多大學(xué)醫(yī)學(xué)院

1. 隊列研究概述

在SWIFT隊列中，共招募了1035名妊娠期間診斷為GDM的婦女，并在產(chǎn)后6至9周時納入研究(研究基線)。在這些患者中，1010名婦女在基線時進(jìn)行2小時75克OGTT的結(jié)果中沒有發(fā)現(xiàn)T2D。在這1010名女性中，959名隨后完成了每年的親自訪問研究，包括研究2小時OGTTs到基線后2年(95%隊列保留)，以重新分類葡萄糖耐量，并/或在基線后8年內(nèi)在KPNC電子健康記錄中進(jìn)行了額外的血糖測試，以診斷T2D新的發(fā)病。在SWIFT研究基線(2008年至2011年)和基線后1年和2年(2009年至2014年)的每個親自隨訪研究中收集空腹血漿樣本。截至2017年12月， 959名在基線及進(jìn)行后續(xù)測試的婦女中沒有發(fā)現(xiàn)T2D，178名婦女(18%)在基線后發(fā)生了T2D(圖1A)。在病例對照研究設(shè)計中，我們根據(jù)糖尿病狀態(tài)和隨訪時間選擇參與者進(jìn)行匹配，173例T2D病例(5個基線樣本無法被衡量)和485例非T2D對照(總共658名女性)，在她們產(chǎn)后6-9周之前獲得空腹血漿樣本，并進(jìn)行代謝組學(xué)分析(基線)。此外，來自同一隊列隨訪的空腹血漿樣本也進(jìn)行代謝組學(xué)分析(98例T2D病例和239例配對的非T2D對照) (圖1A和圖1B)。數(shù)據(jù)分析由3個部分組成：(1) T2D病例和非T2D對照的基線代謝物分布差異建立T2D新發(fā)病的預(yù)測模型，并描述與GDM向T2D過渡相關(guān)的代謝變化；(2) 隨訪樣本與糖尿病病例對照情況的橫斷面分析，揭示T2D相關(guān)的代謝途徑；(3) 通過追蹤個體內(nèi)的代謝變化，進(jìn)行縱向分析以形成并呈現(xiàn)T2D進(jìn)展的軌跡(圖1C)。

2. 隊列研究臨床特點(diǎn)

表1總結(jié)了基線時的社會人口學(xué)和臨床參數(shù)。在產(chǎn)前特征方面，后期患T2D的婦女與未患T2D的婦女在年齡、種族或平等性方面沒有顯著差異。T2D病例組的孕前BMI (p < 0.001)和產(chǎn)前3小時100 g OGTT(葡萄糖值的4個z得分之和；空腹以及禁食1小時、2小時、3小時，p < 0.001)均高于匹配的非T2D對照組，與959名整個隊列的婦女進(jìn)行1年或2年后續(xù)血糖檢測的結(jié)果相似。與非T2D對照組相比，T2D病例組中有糖尿病家族史的人員比例更高(p = 0.018)，且在妊娠期間曾接受胰島素或口服藥物治療(p < 0.001)。在研究基線處，與對照組相比，T2D組的女性有更高的BMI (p = 0.02)、FPG、2小時血糖(2hPG)、空腹胰島素和2小時胰島素(p值均< 0.001)；并且升高了空腹甘油三酯(TAG) (p = 0.005)，空腹ln甘油三酯(p = 0.002)，胰島素抵抗的穩(wěn)態(tài)模型評估(HOMA-IR) (p < 0.001)以及千卡作為動物脂肪在飲食攝入中的百分比(p = 0.006)，但降低了空腹高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) (p = 0.008)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C) (p = 0.044)。空腹總膽固醇、細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)模型評估(HOMA-B)、高血壓百分比、吸煙者百分比、飲食血糖指數(shù)、基線體力活動評分在T2D患者和非T2D對照組之間無顯著差異。

3. 開發(fā)預(yù)測T2D的代謝信號

我們發(fā)現(xiàn)了一個由20個代謝產(chǎn)物組成的特征——己糖、6個AAs、6個甘油磷脂、2個?；鈮A、2個鞘脂類和3個生物氨(圖2A)。在每個隨機(jī)采樣的訓(xùn)練集中使用20個代謝物特征生成一個預(yù)測模型。將模型應(yīng)用于相應(yīng)的輸出測試集中進(jìn)行驗證，并通過AUC、靈敏度、特異度、精密度、F1得分、準(zhǔn)確度對模型的預(yù)測性能進(jìn)行評價。模型生成和評估的過程重復(fù)了100次。常規(guī)的臨床參數(shù)FPG和2hPG也采用同樣的方法進(jìn)行預(yù)測分析。利用20種代謝物的特征，我們得到預(yù)測性能中位數(shù)±SD值AUC = 0.88±0.03，靈敏度0.78±0.05，特異性0.80±0.07，精密度0.79±0.06，F1得分0.79±0.04，準(zhǔn)確度0.79±0.04，優(yōu)于傳統(tǒng)臨床參數(shù)FPG和2hPG或其組合(圖2B)。為了避免任何偏好偏差，我們選擇了具有中值性能的訓(xùn)練/測試分區(qū)來表示接收工作特性曲線，以比較基于不同參數(shù)構(gòu)建的模型(圖2C)。利用該特征，我們得到AUC為0.883 (95%CI = 0.820-0.945，p < 0.001)，優(yōu)于FPG (AUC = 0.69，95%CI = 0.597-0.801，p < 0.001)，2hPG (AUC = 0.694，95%CI = 0.593-0.795，p < 0.001)，以及它們的組合(AUC = 0.745，95%CI = 0.649-0.840，p < 0.001)。有趣的是，當(dāng)將臨床參數(shù)(FPG或2hPG)添加到20個代謝物特征中時，兩種臨床參數(shù)的識別率都沒有提高，只有輕微的提高(圖2D)，這說明使用代謝物特征來預(yù)測糖尿病的意義?？傊覀冮_發(fā)了一種可以預(yù)測T2D的代謝特征，AUC為0.88±0.03。這表明代謝變化在T2D發(fā)病前發(fā)生，這使我們能夠預(yù)測糖尿病并進(jìn)一步探索與T2D發(fā)病相關(guān)的代謝變化。 

4. 基線前瞻性分析：與T2D發(fā)展相關(guān)的代謝變化

在188個被測代謝物中，有141個經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)顯示了T2D病例與非T2D對照之間的可分離性，以及發(fā)病前2組間不同的代謝特征。為了進(jìn)一步描述T2D病例和非T2D對照樣本之間差異表達(dá)的代謝物，我們對單個分析物進(jìn)行線性回歸模型，并進(jìn)行方差分析以評估其意義。這些模型根據(jù)種族、年齡和BMI進(jìn)行了調(diào)整。發(fā)現(xiàn)37種代謝物在T2D病例和非T2D病例中有差異表達(dá)，具有統(tǒng)計學(xué)意義(FDR < 0.05)，包括23個上調(diào)代謝物和14個下調(diào)代謝物(圖3A和圖3B)。我們和其他研究者均報道己糖在T2D病例中增加。在本研究中，基線時己糖是最顯著的代謝物(FDR < 0.001)，非T2D組為5.45±0.8 mM，T2D病例組為6.10±0.1 mM。這表明己糖代謝是最受調(diào)控的，與發(fā)病密切相關(guān)。

在T2D發(fā)病組和非T2D對照組之間，AA代謝也發(fā)生了改變。11種AAs (組氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、酪氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、賴氨酸、色氨酸、蘇氨酸和脯氨酸)上調(diào)，只有谷氨酸下調(diào)。?；鈮A和生物胺(與AA代謝有關(guān))也受到影響。其中，在T2D發(fā)生前觀察到?；鈮AAC3 (FDR = 0.01)、AC10 (FDR = 0.005)、AC16 (FDR < 0.001)增加。亞精胺，一種生物胺，發(fā)現(xiàn)其增加，而另一種胺，犬尿氨酸卻減少。除了這些代謝物外，鞘磷脂也被發(fā)現(xiàn)減少，這與我們之前的研究報道一致。同樣，溶血磷脂酰膽堿(lysoPCs)也下降，但lysoPC26:0除外。有趣的是，在上調(diào)組別和下調(diào)組別中都檢測到來自甘油磷脂組的分析物。上調(diào)的甘油磷脂為PC aa C組(二?；视土字?/span>)，下調(diào)的甘油磷脂為PC ae C組(?；榛视土字?/span>)。

發(fā)展為T2D前的研究基線時，37個差異表達(dá)代謝物與臨床參數(shù)(BMI、FPG、2hPG、空腹胰島素、HOMA-IR、HOMA-B)的相關(guān)性見圖3C。正如所料，己糖與FPG的相關(guān)性最高(r = 0.58，p < 0.001)。它還與空腹胰島素(r =0.30，p < 0.001)和HOMA-IR (r = 0.36，p < 0.001)相關(guān)，而與HOMA-B無關(guān)(r = 0.01，p = 0.71)。相反，代謝物與BMI或2hPG(?0.20 < r < 0.20)的相關(guān)性較低。大部分AAs(及其衍生物)和PC aa C組與空腹胰島素、FPG、HOMA-IR呈正相關(guān)，而PC ae C組與鞘脂類呈負(fù)相關(guān)。BCAAs(亮氨酸、異亮氨酸)、谷氨酸、酪氨酸與空腹胰島素和HOMA-IR 呈正相關(guān)。?；鈮AAC3也與空腹胰島素和HOMA-IR呈正相關(guān)。

為了進(jìn)一步研究T2D發(fā)病的分子通路并尋找受影響的生物學(xué)通路，我們使用KEGG進(jìn)行通路分析。與非T2D對照組相比，在隨訪期間發(fā)現(xiàn)向T2D過渡的女性出現(xiàn)了KEGG中氨?；?/span>-tRNA生物合成途徑(FDR < 0.001)、BCAA生物合成(FDR = 0.004)和精氨酸生物合成(FDR = 0.017)上調(diào)(圖3D)。有趣的是，精氨酸/脯氨酸代謝(FDR = 0.024)也被上調(diào)(圖3D)。這些發(fā)現(xiàn)表明，過度活躍的AA代謝可能在糖尿病發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

5. 隨訪橫斷面分析：與T2D相關(guān)的代謝變化

隨訪樣本(173例隨訪樣本中98例為T2D，而485例隨訪樣本中239例為配對非T2D對照)進(jìn)一步采用橫斷面分析，以鑒定T2D相關(guān)代謝物。與基線時觀察到的情況類似，根據(jù)PLS-DA評分圖中的差異代謝情況，可以將T2D參與者與非T2D參與者分離開，這表明T2D參與者與非T2D參與者之間有顯著的代謝變化。其中，T2D組與非T2D組相比，共鑒定出27個差異代謝產(chǎn)物，具有統(tǒng)計學(xué)意義(p < 0.05)，其中9個上調(diào)，18個下調(diào)。己糖(可能主要是葡萄糖)增加，且其顯著性最高(p < 0.001)。這與T2D的臨床診斷一致。值得注意的是，在所有27個差異調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物中，T2D組中6個AAs(谷氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸)、PC aa C32:1和AC5均高于非T2D組(圖4A和4B)。相反，T2D與非T2D相比，另外14種甘油磷脂、1種AA(甘氨酸)、1種生物胺(肌酐)和2種鞘磷脂[SM(OH)C22:2和SM(OH)C14:1]在血清中降低(圖4A和4B)。這些被調(diào)節(jié)的代謝產(chǎn)物，包括碳水化合物(葡萄糖和果糖)，脂質(zhì)(磷脂和鞘磷脂)，AAs (BCAAs，芳香AAs，甘氨酸)，以前在T2D組(一般成人人群)中報道過。個體的代謝物豐度在參與者之間顯示出差異。

為了進(jìn)一步了解與T2D相關(guān)的代謝變化，我們對所有差異代謝物進(jìn)行了KEGG通路分析。與我們在基線上的發(fā)現(xiàn)相似，KEGG通路分析表明AA代謝受到了嚴(yán)重影響。T2D參與者中氨?；?/span>- tRNA生物合成途徑富集最多(FDR < 0.001)， KEGG中BCAA生物合成和降解途徑富集最多(FDR < 0.001和FDR = 0.023)(圖4C)。更重要的是，葡萄糖-丙氨酸循環(huán)通路被上調(diào)(FDR = 0.013)，在這個通路中氮進(jìn)入尿素循環(huán)并生成葡萄糖(圖4C)。

在圖4D中比較了基線和隨訪期間差異調(diào)節(jié)的代謝產(chǎn)物。在基線時升高的己糖在隨訪中顯示出更大幅度的升高(增加15%)。大多數(shù)AAs維持相同的模式(增加或減少)，除了組氨酸和絲氨酸，它們在基線時增加，但在隨訪時減少(圖4D)。大部分磷脂(lysoPCs和PC ae C組，除了lysoPC a 26:0、16:0、18:0和PC ae C38:1)和鞘脂在兩個時間點(diǎn)上均保持下降趨勢(圖4D)。相反，磷脂的PC aa C組(除了PC aa C38:1和C38:6)在兩個時間點(diǎn)上都保持了上升趨勢。亞精胺和肌酐在兩個時間點(diǎn)維持其模式，而犬尿氨酸在基線時下降，但在隨訪時上升(圖4D)?；€時AC3、AC10、AC16升高，隨訪時恢復(fù)正常，但AC5升高(圖4D)。大多數(shù)在基線時鑒別出的差異調(diào)節(jié)代謝物在隨訪時保持了它們的變化。

6. 縱向分析：與GDM向T2D轉(zhuǎn)化相關(guān)的個體的代謝物

為了進(jìn)一步研究代謝物動力學(xué)并闡明T2D發(fā)病前的代謝路徑，我們追蹤了每個個體體內(nèi)代謝物的動態(tài)變化。在這項縱向分析中，我們選擇了337名參與者，他們在基線和隨訪時都進(jìn)行了分析。隨訪中共98名患者發(fā)展為T2D，被定義為發(fā)展者，239名患者未發(fā)展為T2D，被定義為非發(fā)展者(圖5A)。通過使用多元線性回歸模型，我們確定了10種代謝產(chǎn)物，它們在發(fā)展者和非發(fā)展者之間的發(fā)展過程中發(fā)生顯著變化(p < 0.05, FDR < 0.2)。這10種代謝物——己糖、5種AAs、1種生物胺和3種磷脂——與糖尿病發(fā)展的代謝變化相關(guān)(圖5A)。追蹤每個人體內(nèi)每種代謝物的相對濃度變化，從而形成每種代謝物隨時間變化的軌跡(圖5B)。具體來說，在糖尿病發(fā)展期間，己糖和犬尿氨酸的delta值升高，而其余8種代謝物(組氨酸、絲氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、賴氨酸、lysoPC a C18:0、lysoPC a C18:1、PC ae C34:2)的delta值下降(圖5B)?？v向分析顯示，這10種代謝物的delta值變化有助于T2D發(fā)展(圖5B)。與橫斷面分析(基線和隨訪)相比，這里發(fā)現(xiàn)的差異異常代謝物少得多，這表明在整個T2D發(fā)展過程中，大多數(shù)基線時的代謝變化保持不變。 

7. 建立從GDM到T2D轉(zhuǎn)變的代謝譜：整合基線/隨訪的橫斷面分析和縱向分析

選擇基線/隨訪橫斷面和縱向分析中檢測到的所有差異表達(dá)代謝物，建立GDM向新發(fā)病T2D過渡期間的綜合代謝剖面(圖6A)。在基線和隨訪中，己糖、大多數(shù)AAs(包括BCAAs和芳香AAs)、?；鈮A(AC3和AC10)、生物胺(亞精胺)和二酰磷脂酰膽堿在T2D中均升高(圖6A)。相反，谷氨酰胺、甘氨酸、鞘磷脂、lysoPCs和酰基-烷基-磷脂酰膽堿水平與T2D呈負(fù)相關(guān)(圖6A)。與基線和隨訪的橫斷面研究不同，在縱向研究中只有10種代謝物受到差異調(diào)節(jié)。縱向分析顯示，在過渡期間，己糖和生物胺-犬尿氨酸的delta值增加，而組氨酸、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸和瓜氨酸的delta值則減少(圖6A)。磷脂lysoPC a C18:0, lysoPC a C18:1, and PC ae C34:2的delta值也降低。在縱向分析中沒有統(tǒng)計學(xué)變化的T2D病例個體的分析物在對照組和基線病例之間是一定不同的(圖6A)。這表明，GDM發(fā)展為T2D的女性在基線(產(chǎn)后)存在代謝異常，包括碳水化合物、AAs、?；鈮A和脂類的代謝網(wǎng)絡(luò)(圖6B)。