PCR 是一種 DNA 片段體外復(fù)制技術(shù)，但常有一定的堿基錯配發(fā)生，一般錯配率為 10- 6~ 10- 5.堿基錯配雖然降低了 DNA 序列復(fù)制的保真性，但對獲得新DNA 序列提供了一種可利用的突破口。于是，便出現(xiàn)了易錯 PCR 技 術(shù) （ Error-prone PCR,epPCR） .易 錯PCR 是通過改變 PCR 條件，提高擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基錯配率，從而獲得與原來不同的 DNA 序列或基因。

　　易錯 PCR 作為一種簡便、有效地獲得 DNA 序列變異的技術(shù)，主要是針對特定的基因，這在遺傳和基因改良研究中具有巨大的應(yīng)用前景，但是目前尚無系統(tǒng)的歸納總結(jié)。為此，本文綜述了易錯 PCR 的概念、原理、方法、研究進(jìn)展、應(yīng)用情況以及存在的問題，以期為基因體外誘變工作者提供參考。

　　1 易錯 PCR 的概念和基本原理
　　
　　1. 1 易錯 PCR 的概念
　　易錯 PCR,意為易錯條件下的 PCR,即容易使復(fù)制出的 DNA 序列出現(xiàn)錯誤的 PCR 技術(shù)，又稱錯配PCR 或傾向錯誤 PCR,是指通過利用低保真度 TaqDNA 聚合酶和改變 PCR 反應(yīng)條件，降低 DNA 復(fù)制的保真度，在新 DNA 鏈合成過程中增加堿基錯配，從而使擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)較多點(diǎn)突變的一種體外誘導(dǎo) DNA 序列變異的方法。

　　在 20 世紀(jì) 50 ~ 80 年代，隨著 DNA 體外合成、復(fù)制理論和技術(shù)的逐漸成熟，很多人對 DNA 體外合成、復(fù)制過程中發(fā)生堿基代換的諸多影響因素進(jìn)行研究，以提高基因體外合成的精確性； 同時，還有很多研究者在積極尋求能夠誘導(dǎo)基因產(chǎn)生各種可能變異的有效方法，來模仿自然界核酸、蛋白質(zhì)的進(jìn)化過程。Leung等受以上兩個不同研究方向的啟示，提出了基因在易錯 PCR 條件下產(chǎn)生變異，可以構(gòu)建突變體庫的觀點(diǎn)，并建立了易錯 PCR 技術(shù)體系。該體系于 1992 年經(jīng) Cadwell 和 Joyce進(jìn)一步發(fā)展得到了完善，目前廣泛應(yīng)用的易錯 PCR 技術(shù)多是參照他們的做法。

　　1. 2 易錯 PCR 的基本原理
　　1. 2. 1 堿基的異構(gòu)為錯配提供了可能 組成 DNA 的4 種堿基都有互變異構(gòu)體存在，其中鳥嘌呤 （ G） 、胞嘧啶（ C） 和胸腺嘧啶（ T） 3 種含氧堿基有酮式和烯醇式兩種互變異構(gòu)體，腺嘌呤（ A） 和胸腺嘧啶兩種含氮堿基有胺式、亞胺式兩種互變異構(gòu)體。G、C 和 T 主要以酮式結(jié)構(gòu)存在，烯醇式結(jié)構(gòu)的比率極低，A 和 T 兩種含氮堿基上的氮原子主要以氨基（ NH2） 狀態(tài)存在，以亞胺基（ NH） 狀態(tài)存在的比率極低.不同同分異構(gòu)體之間氫原子位置的不同，及同一位置電子云偏離方向的不同，可使得堿基的配對形式發(fā)生改變，這樣在復(fù)制后的子鏈上就可能出現(xiàn)錯配。例如當(dāng)胸腺嘧啶以酮式結(jié)構(gòu)存在時，與腺嘌呤配對，以烯醇式結(jié)構(gòu)存在時，與鳥嘌呤配對，這樣就出現(xiàn)了 A 能配上 C、T 能配上 G 的不穩(wěn)定堿基對，從而造成錯配.

　　早在 1953 年，當(dāng) Watson 和 Crick提出 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)之后，就提出了在 DNA 復(fù)制過程中出現(xiàn)錯配的原因，可能為堿基異構(gòu)體的存在造成了堿基的錯配。

　　由于這種 A·C、T·G 的含量極低，至今沒有分離到其結(jié)晶體，所以這一結(jié)論目前還停留在生物化學(xué)的理論階段。

　　1. 2. 2 DNA 聚合酶的保真性可以通過改變反應(yīng)條件降低 所有的 DNA 聚合酶在催化 DNA 復(fù)制的過程中都會出現(xiàn)堿基的錯配，不同的 DNA 聚合酶出錯率不同.在已 知 的 幾 種 耐 熱 DNA 聚 合 酶 中，TaqDNA 聚合酶的錯配率最高.Taq DNA 聚合酶是發(fā)現(xiàn)的耐熱 DNA 聚合酶中活性最高的一種，具有 5'-3‘外切酶活性，不具 3'-5’外切酶活性，因此在合成中對某些單核苷酸錯配沒有校正功能，所以比有 3'-5'校對活性的 DNA 聚合酶發(fā)生錯配的概率較高.

　　TaqDNA 聚合酶的最大特點(diǎn)是在高溫下保持酶活性，正是由于這一特點(diǎn)才使得 PCR 技術(shù)得以廣泛應(yīng)用，而 Taq DNA 聚合酶催化 DNA 復(fù)制時出現(xiàn)較低概率的堿基錯配又為人們改變基因提供了可能。不過，正常情況下這一錯配率并不足以誘變一個基因，還需要對 PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行改變，以降低其忠實(shí)度。通過改變 PCR 反應(yīng)條件可以使 Taq DNA 聚合酶的錯誤率得到顯著放大。根據(jù) PCR 不同的目的，對 DNA 聚合酶種類、性能做了更多研究，為了使 DNA 復(fù)制更嚴(yán)謹(jǐn)，發(fā)展出了高保真酶； 為了使 DNA 復(fù)制時變異率提高，以便得到突變體庫，有人試驗(yàn)了選擇那種聚合酶、如何來降低酶的保真性，等等。

　　DNA 聚合酶的保真性可以通過多種方法來降低，包括使用 4 種濃度不同 dNTP、添加 Mn2 +、提高 Mg2 +濃度等。幾種誘變方法導(dǎo)致擴(kuò)增 DNA 鏈堿基變異的機(jī)理各不相同。MnC12是很多 DNA 聚合酶的誘變因子，加入 Mn2 +可以降低聚合酶對模板的特異性，提高錯配率; 4 種 dNTPs 濃度的不平衡可以提高堿基錯誤摻入的概率，實(shí)現(xiàn)錯配; Mg2 +具有激活 Taq 酶的作用，增加 Mg2 +濃度，使之超過正常用量，能穩(wěn)定非互補(bǔ)的堿基對; 提高 Taq DNA 聚合酶用量、增加每個循環(huán)延伸時間，可以增加錯配終端延伸的概率； 降低起始模板濃度，會使后面 PCR 循環(huán)的變異模板比例增加。

　　2 易錯 PCR 技術(shù)的發(fā)展歷程
　　
　　2. 1 易錯 PCR 基本技術(shù)體系的建立與完善
　　易錯 PCR 技術(shù)是采用多種方法提高 DNA 聚合酶的堿基錯配率，并穩(wěn)定非互補(bǔ)堿基對。改變 PCR 反應(yīng)條件的方法主要有 4 種，一是使用低保真度 Taq 酶、并加大 Taq 酶用量； 二是調(diào)整反應(yīng)體系中 4 種 dNTP 的濃度，使之非 1∶ 1∶ 1∶ 1的平衡濃度關(guān)系； 三是在反應(yīng)體系中 加入一 定量的 Mn2 +; 四是增加反應(yīng)體系 中 的Mg2 +濃度。此外，降低起始模板濃度、增加每個循環(huán)的延伸時間、提高反應(yīng)體系 pH 值、增加循環(huán)次數(shù)等也都可以明顯提高誘變率。幾種方法可單獨(dú)使用，但更多的時候是綜合使用，以求最簡單、快捷的得到更多的突變子。

　　在 Leung 等提出的易錯 PCR 體系中，易錯 PCR的變異帶有強(qiáng)烈的傾向性，即 A·T→G·C 的變異率明顯高 于 G · C → A · T 的 變 異 率。在 Cadwell 和Joyce修正的體系中 A·T→G·C 與 G·C→A·T變異比率接近，這樣，基因的誘變文庫會有更好的多樣性，并且不會造成不同堿基含量的顯著變化。目前常用的標(biāo)準(zhǔn)易錯 PCR 方法是參考 Cadwell 等的方案形成的，即： 100μL 反應(yīng)體系，含 7mmol·L- 1MgCl2,0. 5mmol·L- 1MnCl2,50mmol·L- 1KCl,10mol·L- 1Tris-Cl,pH 8. 3（ 25℃ ） ,1mmol·L- 1dTTP 和 dCTP,0. 2mmol·L- 1dATP 和 dGTP,5U 的 TaqDNA 聚合酶； 退火溫度的基本設(shè)計(jì)原則是宜低不宜高； 反應(yīng)不進(jìn)行熱啟動和末端延伸。易錯 PCR 誘變出現(xiàn)的最多變異類型是點(diǎn)突變，刪除引起的移框突變也偶有出現(xiàn)。

　　常規(guī) 的 PCR 100μL 反 應(yīng) 體 系 含 1. 5mmol·L- 1MgCl2、2. 5U 的 TaqDNA 聚 合 酶； 不 含 MnCl2; 4 種dNTP 全部為 0. 2mmol·L- 1.即在易錯 PCR 誘變體系中，Mg2 +濃度提高 4. 7 倍，TaqDNA 聚合酶提高 2 倍，添加 Mn2 +,提高 5 倍的一種或兩種 dNTP 濃度。按以上標(biāo)準(zhǔn)易錯 PCR 體系進(jìn)行誘變，可構(gòu)建無序列傾向性的基因隨機(jī)點(diǎn)突變庫，每個核苷酸的突變率約為 6. 6× 10- 3.

　　Riedel 的研究結(jié)果顯示，易錯 PCR 要根據(jù)情況選擇最佳反應(yīng)條件。一般增加 dATP 和 dTTP 濃度時，宜選擇含有 Co2 +的 Buffer; 而增加 dCTP 和 dGTP 濃度時，宜選擇含有 Mn2 +的 Buffer.PCR 反應(yīng)緩沖液中的K+有利于擴(kuò)增大于 500 bp 長度的 DNA 片段.

　　陳曉穗等通過對錯配 PCR 致突變條件研究認(rèn)為，增加 dTTP 和 dCTP 濃度的致突變效果優(yōu)于增加dATP 和 dGTP 的效果； 使用 5 mmol·L- 1MgCl2、0. 5mmol·L- 1MnCl2、dTTP 和 dCTP 濃度提高到 1 mmol·L- 1的條件下，經(jīng) 2 輪 PCR（ 共 60 個循環(huán)） 堿基錯配率可達(dá) 2. 4% .其突變類型有明顯偏向性，以 A/T 的突變?yōu)橹?，轉(zhuǎn)換多于顛換。

　　由 Cadwell 和 Joyce完善的易錯 PCR 技術(shù)是通過增加 DNA 聚合酶的錯誤率來誘導(dǎo)基因變異，這種方法得到的誘變率在 0. 6% ~ 2. 0% /bp/PCR 之間，目前這種誘變方法已經(jīng)很成熟，很多大型生物試劑公司都有了這種基因體外誘變方法的試劑盒。利用試劑盒誘變雖然簡單，但類型單一，因此在實(shí)際操作中，常常根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶σ族e PCR 進(jìn)行修改、補(bǔ)充和完善。

　　2. 2 連續(xù)易錯 PCR
　　在通常情況下，經(jīng)一輪的易錯 PCR、定向篩選，很難獲得令人滿意的結(jié)果，由此發(fā)展出了連續(xù)易錯 PCR（ Sequential error-prone PCR） ,該方法是將一次 PCR 擴(kuò)增得到的有益突變基因作為下一次 PCR 擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)進(jìn)行隨機(jī)誘變，使得每一次獲得的少量有益突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。連續(xù)兩輪 PCR,或連續(xù)多輪易錯 PCR,突變率可增至一輪易錯 PCR 的 3倍.

　　誘變技術(shù)的基本要求是創(chuàng)造盡可能多的突變體，但堿基突變率并非越高越好，因?yàn)橛幸嫱蛔兺ǔＲ扔泻ν蛔兊淖儺惵实秃芏?，一個突變分子中所含的有益突變很有可能會被同時存在的有害突變所抵消或淹沒。因此，連續(xù)易錯 PCR 要根據(jù)基因具體情況設(shè)計(jì)每一輪 PCR 的誘變率，建立突變體庫，通過高通量篩選，獲得有益突變，然后再以其為模板，進(jìn)行第二輪易錯PCR,不斷富集有益基因。

　　2. 3 與 DNA 改組、模板交錯延伸等的聯(lián)合應(yīng)用
　　易錯 PCR 技術(shù)在體外分子進(jìn)化的研究中，可以單獨(dú)使用。隨著 DNA 改組（ DNA shuffling）和模板交錯延伸（ StEP）等技術(shù)方法的出現(xiàn)，易錯 PCR還可以和這些方法聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)變異圃廣、變異率高、有益基因出現(xiàn)頻率高、篩選變異工作量小的最終目的。

　　DNA 改組是指將一組相關(guān) DNA 序列切割成隨機(jī)片段后通過 PCR 進(jìn)行重新聚合，從而產(chǎn)生突變體。模板交錯延伸是一種簡化的 DNA 改組技術(shù)，是將模板混合后進(jìn)行短暫的復(fù)性和延伸反應(yīng)，這樣在每個循環(huán)中，延伸的片段在復(fù)性時會與不同的模板配對，最終合成全長 DNA 序列。它省去了 DNA 改組中的酶切程序。DNA 改組技術(shù)相當(dāng)于一組相關(guān)基因不同序列間的重新排列組合，因此誘變的有益突變率相對較高。

　　易錯 PCR 多用于高頻率誘變單個基因，與 DNA改組技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可以集二者的優(yōu)點(diǎn)，這樣不僅可以對單一基因進(jìn)行易錯 PCR 隨機(jī)誘變，創(chuàng)造新的基因，還可以將易錯 PCR 獲得的有益基因改組，進(jìn)行序列間的重新編排，從而獲得不同種、屬基因家族里基因序列變異圃更廣、功能更強(qiáng)的基因。一般做法是先用易錯PCR 引入點(diǎn)突變，構(gòu)建起始基因文庫，篩選出所有良性克隆，再以此作為親本基因進(jìn)行 DNA 改組，使得有益突變迅速積累，基因功能明顯提高。而且，這樣所建的突變體庫小，定向進(jìn)化效果顯著。也可以進(jìn)行多輪改組，得到更好的結(jié)果.因此，易錯 PCR 與 DNA改組聯(lián)合應(yīng)用逐漸成為基因誘變的主要方法之一。

　　An 等將易錯 PCR 與模板交錯延伸相結(jié)合，并使之在同一 PCR 管內(nèi)進(jìn)行，簡化了操作程序。具體操作過程為： 以 15 個以下循環(huán)的易錯 PCR 引入隨機(jī)變異，PCR 誘變產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀純化后，再作為模板和引物，直接進(jìn)行交錯延伸程序進(jìn)行 DNA 重組。該方法以腺苷甲硫氨酸 （ AdoMet） 合成酶基因 sam1 的誘變?yōu)槔?，建庫證實(shí) 有效，并得到了在 體 內(nèi) 表 達(dá) 量 增 加56% 的突變子。

　　2. 4 易錯 PCR 誘變方法的補(bǔ)充與完善
　　易錯 PCR 為以 PCR 為基礎(chǔ)的誘變開辟了一條新路，不少學(xué)者在沿著這條路尋找新的或更加完善、更加簡便的誘變技術(shù)，如醇介導(dǎo)的易錯 PCR、易錯 PCR 與交錯延伸聯(lián)合簡化誘變方法，以及堿基類似物與易錯PCR 混合使用方法等。

　　Claveau研究了醇介導(dǎo)的易錯 PCR.即在 PCR反應(yīng)體系中加入異丙醇、丙醇或丁醇，根據(jù)酶的耐熱性和醇的疏水性不同，醇的臨界濃度也不同。醇的臨界濃度一般隨著聚合酶抗熱性增加而提高，隨醇自身的疏水性提高而降低。研究顯示醇的疏水性是影響聚合酶構(gòu)象 的重要因 素。當(dāng)丙醇在體 系 中 的 體 積 比 為7. 0% 到 8. 0% 時誘變率可以達(dá)到 9. 8 × 10- 3/ bp /PCR.這一條件下優(yōu)先得到堿基 G 和 C 的改變，而與此相反，標(biāo)準(zhǔn)易錯 PCR 優(yōu)先改變堿基 A 和 T.丙醇與MnCl2作用方式不同，丙醇對聚合酶保真性降低的作用是對聚合酶穩(wěn)定性精細(xì)調(diào)節(jié)的結(jié)果。

　　以上的易錯 PCR 研究全部采用改變 PCR 反應(yīng)條件，來提高 DNA 聚合酶錯誤率的方法進(jìn)行，也有人嘗試通過修飾 DNA 聚合酶來提高常規(guī) PCR 錯配率的研究。Benjamin 和 Connolly 于 2004 年報(bào)道了一個 PfuDNA 聚合酶的變種在易錯 PCR 反應(yīng)中表現(xiàn)出極好的性能。Pfu DNA 聚合酶有兩個 α 螺旋構(gòu)成了聚合酶的指狀子域，這一區(qū)域負(fù)責(zé)將堿基與模板鏈正確地互補(bǔ)配對。當(dāng)兩個 α 螺旋之間的關(guān)鍵氨基酸發(fā)生變異，與缺失 3'-5‘核酸外切酶活性同時發(fā)生時，一個高保真野生型聚合酶就變?yōu)榱艘粋€低保真聚合酶。這個 PfuDNA 聚合酶變種能夠在標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)條件下用于誘變基因，并得到高頻率、幾乎沒有任何傾向的變異.這些都是對易錯 PCR 研究的新探索和有益補(bǔ)充。

　　3 易錯 PCR 技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展前景
　　
　　易錯 PCR 從概念提出、體系完善至今已被廣泛應(yīng)用于生物工程的各個領(lǐng)域。

　　3. 1 易錯 PCR 技術(shù)為特種工業(yè)酶的改造提供了有效的工具
　　工業(yè)酶的催化反應(yīng)通常處于高溫、有機(jī)溶劑、氧化劑、極端酸堿等存在的環(huán)境。在自然界進(jìn)行選擇，根本無法篩選到能在上述惡劣條件下完成催化反應(yīng)的酶。

　　運(yùn)用易錯 PCR 技術(shù)，在人工模擬環(huán)境下進(jìn)行選擇，已經(jīng)成功地得到了各種特種功能的工業(yè)酶，可滿足工業(yè)生產(chǎn) 的 特 殊 需 要。例 如，Zhao 等利 用 連 續(xù) 易 錯PCR 獲得了枯草桿菌蛋白酶基因的隨機(jī)點(diǎn)突變，并用交錯延伸方法重組 DNA,連續(xù)提高培養(yǎng)溫度對突變體進(jìn)行篩選，最終獲得一株突變體 E5-3H5,不僅將酶的最適溫度提高了 17℃ ,還使酶在 65℃ 的半衰期增加了 200 倍。淀粉蔗糖酶是一種催化蔗糖合成直鏈淀粉的酶，Potocki-Veronese 等利用易錯 PCR 和 DNA 改組技術(shù)對其進(jìn)行突變，得到催化蔗糖活性提高 60% 的突變體 Asn387Asp.易錯 PCR 是蛋白質(zhì)分子體外定向進(jìn)化研究最早采用的一種構(gòu)建基因文庫的方法，尤其是在酶分子誘變上研究應(yīng)用最多。

　　3. 2 在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中的應(yīng)用
　　中國科學(xué)院遺傳所朱禎實(shí)驗(yàn)室采用易錯 PCR 方法獲得了水稻抗草甘膦突變基因 epsp102,突變體對草甘膦和磷酸烯醇式丙酮酸的親和力分別達(dá)到 70 倍和4. 6 倍.蘇軍等將 epsp 突變基因?qū)攵i稻明恢86,對 T3材料進(jìn)行抗性檢測，顯示種子萌發(fā)時對草甘膦的抗性提高 15 倍，三葉期對草甘膦的抗性提高 3 ~4 倍。

　　在植物的遺傳、育種研究中，最缺乏的已經(jīng)不再是轉(zhuǎn)基因和常規(guī)雜交的手段，而是缺乏優(yōu)異基因。有了專一性優(yōu)異基因，農(nóng)業(yè)中的高產(chǎn)、抗逆、抗病蟲、抗除草劑等新品種、新材料就會快速脫穎而出。易錯 PCR 為我們提供了一種實(shí)驗(yàn)室快速獲得優(yōu)質(zhì)基因的手段。

　　3. 3 在醫(yī)藥研究中的應(yīng)用
　　易錯 PCR 技術(shù)已成為生物制藥研究的有效工具。例如，粘質(zhì)沙雷氏菌是多種病癥的致病菌。劉治江等以重組 E. coli BL21（ DE3） pLysS/pET22b-ChiC 為親本，采用易錯 PCR 對粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶 C 基因（ Chi C） 進(jìn)行定向進(jìn)化，經(jīng)過兩輪易錯 PCR,建立突變體文庫，通過篩選獲得一個酶活較高的突變酶（ Mut-Chi C） ,其催化活性為親本重組酶的 1. 9 倍，比活力為出發(fā)菌酶活的 3. 3 倍，最適溫度由 40℃ 提高到 60℃ .對進(jìn)化酶基因測序發(fā)現(xiàn)，該基因所編碼蛋白有 4 處氨基酸被取代，均為有義突變。

　　此外，易錯 PCR 技術(shù)在基礎(chǔ)理論研究、生物制藥、基因治療、疫苗研制、石油化工等研究領(lǐng)域也具有廣闊的應(yīng)用前景。

　　4 應(yīng)用特點(diǎn)及存在問題
　　
　　易錯 PCR 可以隨機(jī)誘變?nèi)魏我粋€克隆基因，建立突變體庫，從而掃描到理想性狀的表達(dá)序列。誘變中應(yīng)注意選擇最接近人們需要的基因作為起點(diǎn)，若用于理論研究，應(yīng)控制較低的突變率，使突變多為單一氨基酸取代，這樣才能將基因功能變化與突變表型一一對應(yīng)起來。第二個需要注意的問題是控制 DNA 的合適突變頻率。如果 DNA 的突變頻率太高，產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白將失去活性，如果突變頻率太低，突變位點(diǎn)過少，野生型的背景太高，樣品的多樣性則較少，不利于后續(xù)的篩選和鑒定工作。對于每一 DNA 序列來說，理想的堿基置換率和易錯 PCR 的最佳條件依賴于隨機(jī)突變的目標(biāo) DNA 片段的長度。一般每代每序列有 2 ~ 3 個堿基置換或一個氨基酸替代較為適宜.

　　易錯 PCR 方法雖然已廣泛應(yīng)用，但還是存在一些問題，首要問題是堿基的變異具有傾向性.即在四種堿基比例不平衡的情況下，A·T→G·C 的變異比率通常高于 G·C→A·T 的變異比率，這樣就會影響變異的多樣性，所以在用此方法誘變基因時，一定要注意選擇誘變條件。二是易錯 PCR 產(chǎn)量和變異水平偏低。較低的模板濃度以及引物與模板結(jié)合嚴(yán)格性的降低，使得目標(biāo)片段的產(chǎn)量偏低由于堿基變異偏好、轉(zhuǎn)換高于顛換,造成變異圃較窄，篩庫得到有益基因的概率降低。三是對模板的要求較高，最好是只含目的基因的 DNA 片段。PCR 在易錯條件下進(jìn)行時，容易造成引物與模板的錯誤結(jié)合，形成大量與目的片段不同長度的非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，模板越長，這種非特異擴(kuò)增的概率會越大。另外，應(yīng)用易錯 PCR 時一般都要針對具體基因進(jìn)行誘變條件的優(yōu)化，需要優(yōu)化的條件有多個，包括 Mn2 +濃度、Mg2 +濃度、4 種 dNTP 濃度、TaqDNA 聚合酶濃度、模板濃度、延伸時間、循環(huán)次數(shù)等，這些條件綜合起來優(yōu)化還比較費(fèi)力。

　　針對以上問題，可能的解決途徑有以下幾個： 一是從 Taq DNA 聚合酶的基本特性入手，尋找新的影響酶功能、同時又不帶來堿基變異偏好的因素，開發(fā)更多的易錯 PCR 方法，用于不同目的的誘變，或?qū)で蟾训恼T變方法。Taq DNA 聚合酶的基本性質(zhì)中，Mg2 +依賴性和幾種變性抑制劑對于酶的錯誤率有很大影響，可以做為研究的目標(biāo)。在此研究方面，Claveau 等做了成功的嘗試，通過醇的疏水性影響 Taq 酶的構(gòu)象，提高了堿基錯配率。但醇介導(dǎo)的易錯 PCR 出現(xiàn)了 G·C→A·T 的變異偏好，仍不理想。二是易錯 PCR 多種誘變條件的簡化。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，多種誘變條件對堿基錯配率的貢獻(xiàn)不同，對于貢獻(xiàn)大的因素，有 2 ~ 3 個條件即可得到 2% 左右的堿基錯配率，這樣就大大簡化了誘變前期的條件優(yōu)化工作。

　　隨著研究的不斷深入，易錯 PCR 技術(shù)會日臻完善，并更多地應(yīng)用到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，創(chuàng)造更豐富的資源、更多的優(yōu)異基因。

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