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MDx 2020精彩預告 近年分子診斷在體外診斷細分板塊中以破軍之勢一路走高，加之2019年末疫情公衛(wèi)事件的爆發(fā)，更是將核酸檢測/分子診斷帶向市場風口與焦點所在。由此，已經(jīng)成功舉辦五屆的MDx2020第六屆中國先進分子診斷技術與應用論壇將于8月6-7日在上海嶄新上線。論壇將深度探討分子診斷“病原檢測+腫瘤診斷”兩大潛力應用場景下，技術及產品的申報注冊與評價驗證、mNGS、PCR、液體活檢等技術在病原檢測中的開發(fā)挑戰(zhàn)與應用、NGS下的大panel腫瘤檢測產品的注冊與評價、CRISPR檢測等革命性前沿技術的實踐突破對于行業(yè)的刺激與啟示等分子診斷行業(yè)年度熱門議題，與行業(yè)專家共探先鋒技術開發(fā)與產品申報落地之路！ 共抗疫情 在中國疫情防控工作取得了明顯成效的時候，境外疫情暴發(fā)增長態(tài)勢卻仍在持續(xù)，導致我國外防輸入壓力增大，國內防止疫情反彈的復雜性也在增加。為貫徹落實常態(tài)化疫情防控工作中“外防輸入、內防反彈”的工作要求，進一步強化醫(yī)療機構感染防控的各項措施，最大限度降低院內感染，鞏固來之不易的防控成果，國務院于5月1日發(fā)布了《關于落實常態(tài)化疫情防控要求進一步加強醫(yī)療機構感染防控工作的通知》，強調： 1.充分認識院內感染防控面臨的嚴峻形勢 2.嚴格落實發(fā)熱門診管理要求 3.加強患者收入院管理 4.強化新冠病毒核酸檢測 5.嚴格落實標準預防 6.開展院內感染風險排查整頓 其中關于核酸檢測能力方面強調“各地應當加強醫(yī)療機構實驗室建設，對所有三級醫(yī)院以及縣醫(yī)院開展建設，使其迅速達到新冠病毒核酸檢測條件；對其他二級以上醫(yī)院也應當同時加強建設，使其逐步達到新冠病毒核酸檢測條件，根據(jù)疫情防控形勢需要隨時能夠開展核酸檢測工作?！?/p> 一般三級醫(yī)院都擁有標準PCR實驗室與具備核酸檢測的能力。而此次對二級醫(yī)院也提出同樣要求，意味著二級醫(yī)院也需要配備PCR實驗室。根據(jù)國家衛(wèi)健委公布的最新數(shù)據(jù)，截止2019年2月底我國三級醫(yī)院2582所，二級醫(yī)院9061所，一級醫(yī)院10084所。由此可以預見全國各地將迎來PCR實驗室建設的熱潮。本文就PCR實驗室設計、裝修，相關儀器設備，人員配置及管理做了如下總結，供大家交流學習。 場地要求及實驗室設計 場地要求一般參照以下文件： 《醫(yī)療機構管理條例》 《醫(yī)療機構臨床實驗室管理辦法》 《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》 《醫(yī)療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》 標準的PCR實驗室一般分為四個區(qū)，一區(qū)為試劑準備區(qū)，二區(qū)為標本制備區(qū)，三區(qū)為PCR擴增區(qū)，四區(qū)為產物分析區(qū)。為避免交叉污染，進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應混合物配制和擴增區(qū)→擴增產物分析區(qū)。各實驗區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應通過傳遞窗進行。場地一般要求在80平米以上，此標準PCR實驗室可開展包括新冠病毒在內的常規(guī)分子檢測項目。而如今市面上絕大部分新冠病毒檢測試劑盒是在熒光定量PCR平臺上開發(fā)的，因此沒有產物分析區(qū)也不會影響新冠病毒的檢測，60-80平米的場地就能滿足要求，但是其他如基于一代測序與基因芯片的檢測項目就無法開展。大致設計如下圖：  PCR實驗室的場地限制條件較多，且因時間要求更為緊迫，部分醫(yī)院可能連50平米的場地都無法提供，為了能盡快滿足各醫(yī)院的新冠病毒檢測需求，一個非常緊湊的PCR實驗室可以將空間設計在僅為35平米左右，但是其防污染能力較差，小編不推薦。 不管是幾個區(qū)，可將PCR過程分成試劑準備、標本制備和PCR擴增檢測三個獨立組成。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區(qū)設置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產物對人員和環(huán)境的污染。 在三個實驗區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準備區(qū)和標本制備區(qū)還設置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。   試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。 地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好，便于進行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚，瓷磚間接縫需要小于2mm。 PCR實驗室空調通風系統(tǒng)設計及壓力控制 PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。 1、試劑貯存和準備區(qū) 該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內，并在本區(qū)內制備成所需的貯存試劑。 對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴格的要求。 2、標本制備區(qū) 該區(qū)域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。 本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區(qū)內不必要的走動。 3、擴增反應混合物配制和擴增區(qū) 該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū)) 的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區(qū)) 制備成反應混合液等也可在本區(qū)內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內進行。 本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區(qū)內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。 4、擴增產物分析區(qū) 該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設。 本區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。 PCR實驗室污染的預防與控制 PCR實驗室設計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結果必須作廢，需重新進行實驗。所以發(fā)生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應是預防，而不是排除。 1、工作區(qū)域的嚴格劃分 （1）各個實驗區(qū)域設置合理； （2）各個實驗區(qū)域要有明顯的標記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實驗區(qū)域設備物品、試劑等發(fā)生混淆。 2、合理的系統(tǒng)設置 （1）合理的空調通風系統(tǒng)設置，盡量采用全送全排的空調系統(tǒng)； （2）嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區(qū)內不同的壓力要求。 3、規(guī)范的操作 （1）臨床基因擴增檢驗實驗室的技術人員必須進行上崗培訓，經(jīng)培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作； （2）在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施； （3）清潔工作及時、正確。實驗工作結束后，必須立即對本區(qū)進行清潔。除常規(guī)的消毒液體對表面進行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實驗設備還應進行高壓消毒處理。 4、嚴格的管理 （1）嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關的人員不得隨意進出實驗室，有條件的情況下要設置獨立的通道和進出整個實驗區(qū)的門； （2）在各個實驗區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標志的工作服（如不同顏色），當工作人員離開時不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域； （3）盡量減少在實驗區(qū)內不必要的走動以減少交叉污染的可能性。 （4）擴增產物分析區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等； （5）擴增產物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質，應特別注意實驗人員的安全防護。 5、完備的實驗室配套設施 完備的實驗室配套設施是保證實驗工作的必要條件，應根據(jù)各個實驗室實驗內容的不同配備相應的設備和儀器，如超凈工作臺、離心機、加樣器等。 PCR實驗室主要設備見下表 本表所列儀器為滿足新冠病毒檢測所需的最低配置，空調排風系統(tǒng)等不算在內。  PCR實驗室質量控制 為實現(xiàn)高質量的檢測結果，采取嚴格的實驗室管理體系極為重要 根據(jù)實驗室的具體情況制定和編寫質量體系文件，《質量手冊》、《程序文件》、《作業(yè)指導書》，并嚴格執(zhí)行。 管理體系的特點是應有明確的目的、規(guī)范的管理、有效的制約、高效并自我調節(jié)的機制，具體要求如下： 建立完善的SOP文件，對完成各項質量活動的方法作出規(guī)定，每個SOP都應對一個或一組相互關系的活動進行描述。 每個SOP文件應說明該項質量各環(huán)節(jié)的輸入、轉換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關活動的接口關系。 明確每個環(huán)節(jié)轉換過程中各項因素的要求，即由誰做、做什么、做到什么程序、達到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報告，以及相應的審批手續(xù)。 規(guī)定在質量活動中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施。SOP應簡練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴格遵守。 盡量減少在實驗區(qū)內不必要的走動以減少交叉污染的可能性。擴增產物分析區(qū)是最主要的擴增產物污染來源，廢液必須經(jīng)消毒液浸泡后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的一次性材料也應經(jīng)消毒液浸泡后統(tǒng)一處理。 用到某些有毒物質，應特別注意實驗人員的安全防護。完備的實驗室配套設施是保證實驗工作的必要條件。 人員配置 為保障實驗室的正常運行需要1名副高職稱以上的檢驗技術人員，2名中級職稱以上的檢驗技術人員，目前對新冠病毒檢測能力需求迫切，但是一個高質量PCR實驗室的建設也不是在朝夕之間能完成。 文章資料整理自： 檢驗星空、盾恩醫(yī)學  |
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