功能性便秘（functional constipation，F(xiàn)C）是功能性腸病的一種，是指由非器質(zhì)性原因引起的便秘，又稱(chēng)特發(fā)性便秘，可分為排空遲緩型、功能性出口梗阻型和合并或混合型。其典型臨床表現(xiàn)為長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)性排便困難、排便不盡感或無(wú)便意感^[1]。FC屬中醫(yī)“便秘”范疇，基本病機(jī)為大腸傳導(dǎo)中的“魄門(mén)亦為五臟使”說(shuō)明便秘的形成與脾、胃、肝、腎、肺等臟腑功能失調(diào)有關(guān)。據(jù)其病機(jī)將便秘分為實(shí)證和虛證，實(shí)證為肺熱下移大腸或胃腸積熱，致大腸津液干枯，傳導(dǎo)失職；虛證為素體虛弱或久病之后，氣虛大腸傳導(dǎo)無(wú)力。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)FC發(fā)病機(jī)制研究等多種因素有關(guān)。

柴胡加芒硝湯出自《傷寒論》，由柴胡二兩十銖（8 g）、黃芩一兩（3 g）、人參一兩（3 g）、炙甘草一兩（3 g）、生姜一兩（切）（3 g）、半夏二十銖（洗）（2.1 g）、大棗四枚、芒硝二兩（6 g）共8味藥組成，從方劑組成和用量來(lái)說(shuō)，柴胡加芒硝湯是由小柴胡湯三分之一的劑量加入芒硝而成，方中主要化學(xué)成分有柴胡皂苷類(lèi)、黃芩苷類(lèi)、人參皂苷類(lèi)等多種活性物質(zhì)以及礦物含水硫酸鈉，具有和解少陽(yáng)、瀉熱去實(shí)的功效。根據(jù)《傷寒論》第104條的描述“傷寒十三日，不解，胸脅滿(mǎn)而嘔，日晡所發(fā)潮熱，已而微利。此本柴胡證，下之以不得利，今反利者，知醫(yī)以丸藥下之，此非其治也。潮熱者，實(shí)也。先宜服小柴胡湯以解外，后以柴胡加芒硝湯主之?！迸c傷寒病結(jié)合六經(jīng)證治的認(rèn)識(shí)^[7]，此方與小柴胡湯先后使用，用于治療太陽(yáng)十三日不解旁涉陽(yáng)明，波及腸腑引起的里熱實(shí)證便秘，同時(shí)還可用于調(diào)暢三焦氣機(jī)治療因選擇“丸藥”下法誤治太陽(yáng)旁涉陽(yáng)明實(shí)熱便秘引起的正氣受損^[8]?，F(xiàn)代臨床也發(fā)現(xiàn)柴胡加芒硝湯治療FC有一定療效，但相關(guān)作用靶點(diǎn)和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)均尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，其注重藥物間相互作用的特點(diǎn)與中醫(yī)藥學(xué)多采用復(fù)方配伍治療相吻合，通過(guò)“成分-靶點(diǎn)”和“疾病-靶點(diǎn)”2大系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)，為傳統(tǒng)方劑現(xiàn)代藥理學(xué)研究與機(jī)制探討提高了準(zhǔn)確度，也搭建了“橋梁”。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過(guò)構(gòu)建方劑化合物靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)的互作網(wǎng)絡(luò)，從分子功能和通路機(jī)制上預(yù)測(cè)柴胡加芒硝湯治療FC的關(guān)鍵成分與潛在機(jī)制。

1  方法

1.1  柴胡加芒硝湯所含成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的收集和篩選

本研究采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP（http://lsp./tcmsp.php），以柴胡、黃芩、人參、甘草、生姜、半夏、大棗為關(guān)鍵詞，檢索這7味藥的化學(xué)成分。借助TCMID（http://www.ehbio. com/TCMIP/index.php/Home/Index/index.html）平臺(tái)查找TCMSP未收錄的芒硝的化學(xué)成分。本研究結(jié)合口服生物利用度（OB≥30%）和類(lèi)藥性（DL≥0.18），對(duì)所收集到的化學(xué)成分進(jìn)行篩選，并結(jié)合《中國(guó)藥典》2015年版中藥物的含量測(cè)定項(xiàng)對(duì)已篩選的化合物進(jìn)行補(bǔ)充，最終建立柴胡加芒硝湯的成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。從TCMSP中查詢(xún)柴胡加芒硝湯化合物對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，并在Unitprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. Unitprot.org/）查詢(xún)靶標(biāo)蛋白的基因名稱(chēng)。對(duì)于尚未在TCMSP中收錄靶點(diǎn)的化合物，在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm./）查詢(xún)化合物的Canonical SMILES序列，并利用此序列在Swiss Target Prediction在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. swisstargetprediction.ch/）中對(duì)該化合物的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，收集預(yù)測(cè)結(jié)果中的靶標(biāo)蛋白基因名稱(chēng)。

1.2  FC疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

在TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://s. edu.sg/）、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http:///）、PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm./pubmed）中以關(guān)鍵詞“functional constipation”或“constipation”進(jìn)行檢索，對(duì)FC相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行收集。通過(guò)閱讀FC臨床診療指南總結(jié)出治療FC的上市藥物，在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索（https://www. drugbank.ca/），收集相關(guān)藥物的作用靶點(diǎn)。將以上檢索結(jié)果合并，去除重復(fù)值，作為FC的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)庫(kù)。

1.3  成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用Cytoscape 3.6.0軟件建立柴胡加芒硝湯篩選后成分與成分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的“柴胡加芒硝湯-活性成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。將柴胡加芒硝湯化合物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行合并，刪除重復(fù)值，利用String在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https:///）對(duì)FC疾病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和柴胡加芒硝湯成分的作用靶點(diǎn)分別構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并以TSV格式導(dǎo)出2個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果。利用Cytoscape軟件對(duì)2個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行交集分析，得到化合物-疾病的共有靶點(diǎn)，利用交集出的共有靶點(diǎn)結(jié)合化合物成分建立柴胡加芒硝湯化合物-FC靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape軟件對(duì)化合物-FC靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行節(jié)點(diǎn)度（dregree）值篩選，得到關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)，并構(gòu)建核心成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)。

1.4  GO生物學(xué)功能分析及KEGG通路富集分析

利用Cytoscape 3.6.0軟件中的ClueGO插件針對(duì)核心成分-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO分析和通路富集分析，通過(guò)通路富集結(jié)果對(duì)柴胡加芒硝湯治療FC的機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.5  FC機(jī)制的文獻(xiàn)挖掘

2  結(jié)果與分析

2

從TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索柴胡加芒硝湯各味藥的化合物成分，并依據(jù)OB≥30%及DL≥0.18要求，得到最終選定的結(jié)果為206個(gè)化合物，其中柴胡18個(gè)、黃芩34個(gè)、人參24個(gè)、甘草94個(gè)、生姜8個(gè)、半夏12個(gè)、大棗26個(gè)、芒硝2個(gè)。從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取所選化合物的靶標(biāo)蛋白，在TCMSP信息不足時(shí)，用化合物的CanonicalSMILES序列在SwissTarget Prediction在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)靶點(diǎn)作為補(bǔ)充錄入成分-靶點(diǎn)庫(kù)。利用Cytoscape軟件進(jìn)行“柴胡加芒硝湯-成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，見(jiàn)圖1。

2.2  成分靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)的互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

在TTD、CTD、PubMed、TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)中以關(guān)鍵詞“functional constipation”或“constipation”進(jìn)行檢索，收集與FC相關(guān)的靶點(diǎn)，在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索上市藥物的作用靶點(diǎn)。將以上檢索結(jié)果合并，并去除重復(fù)值，得到326個(gè)疾病靶點(diǎn)。

采用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http:///）構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用Multiple proteins工具，限定物種為人（Homo sapiens），獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，并保存其TSV格式文件，得到圖2-A，共涉及282個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 524條邊。采用相同方法對(duì)柴胡加芒硝湯成分的靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，得到圖2-B，共涉及939個(gè)節(jié)點(diǎn)，25 285條邊，并保存其TSV格式文件。

利用TSV文件在Cytoscape中編輯PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Merge功能整合化合物-疾病的交集靶點(diǎn)，并構(gòu)建化合物-疾病交集靶點(diǎn)與柴胡加芒硝湯成分的互作網(wǎng)絡(luò)，采用節(jié)點(diǎn)degree值篩選的方法對(duì)互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，見(jiàn)圖3，其中左側(cè)中心表示皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、甾醇類(lèi)等關(guān)鍵成分64個(gè)。右側(cè)中間紅色是靶點(diǎn)的篩選結(jié)果，共得OPRD1、CFTR、HTR2A等30個(gè)核心靶點(diǎn)。對(duì)柴胡芒硝湯治療FC的30個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行可視化處理，結(jié)果共涉及30個(gè)節(jié)點(diǎn)，65條邊，見(jiàn)圖4-A。圖中的節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示蛋白間的相互關(guān)聯(lián)，互作網(wǎng)絡(luò)中圖節(jié)點(diǎn)的大小與此節(jié)點(diǎn)的degree值呈正比。查閱關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的生物學(xué)活性，按生物學(xué)活性分類(lèi)，見(jiàn)圖4-B。從分類(lèi)結(jié)果可知，核心靶點(diǎn)生物學(xué)活性主要分布于5-羥色胺受體、腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)受體、絡(luò)氨酸蛋白激酶受體、對(duì)外源性異物刺激的反應(yīng)等幾個(gè)相關(guān)通路中。

2.3  成分-疾病交集靶點(diǎn)GO生物學(xué)功能分析及KEGG通路富集分析

將總結(jié)的柴胡加芒硝湯治療FC的30個(gè)核心靶點(diǎn)通過(guò)Cytoscape中的插件ClueGO進(jìn)行通路富集分析和生物學(xué)功能分析。結(jié)果見(jiàn)圖5、6。

阿片受體活性（opioid receptor）、機(jī)體的水平衡、胺配基結(jié)合受體的活性（response to ammoniumion）等多個(gè)生物過(guò)程及分子功能相關(guān)。

從圖6可知，對(duì)30個(gè)核心靶標(biāo)所參與的主要KEGG通路富集信息進(jìn)行分析，得柴胡加芒硝湯主要通過(guò)調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝（arachidonicacid metbolism）、MECP2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（transcriptional regulation byMECP2）、細(xì)胞色素P450（cytochrome P450-arranged bysubstrate type）、生物胺配基結(jié)合受體（amineligand-binding receptors）、5-羥色胺受體（serotoninreceptors）、PI3K的異常表達(dá)（constitutive signaling by aberrantPI3K in cancer）、受體型蛋白酪氨酸激酶（signalingby FGFR1）、外源性異物刺激（xenobiotics）等作用通路發(fā)揮對(duì)FC的治療作用。

2.4  結(jié)合文獻(xiàn)挖掘的結(jié)果對(duì)柴胡加芒硝湯治療FC的機(jī)制進(jìn)行確認(rèn)

通過(guò)文獻(xiàn)挖掘^[9-21]，對(duì)FC的發(fā)病機(jī)制、一線治療藥物的藥效機(jī)制和以FC為副作用的部分藥物作用機(jī)制等進(jìn)行總結(jié)，見(jiàn)圖7?？偨Y(jié)對(duì)應(yīng)的機(jī)制發(fā)現(xiàn)柴胡加芒硝湯主要通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子受體、調(diào)節(jié)阿片類(lèi)受體、激動(dòng)5-HT受體、調(diào)節(jié)氯離子膜上轉(zhuǎn)運(yùn)受體、影響G蛋白偶連受體等通路發(fā)揮對(duì)FC的治療作用，預(yù)測(cè)相關(guān)靶點(diǎn)分別為OPRD1、OPRK1、OPRM1、CFTR、CAMK2B、HTR2A、HTR2B、HTR2C、HTR3A。

3  討論

柴胡加芒硝湯載于《傷寒論》，屬“膽與胃腸兼證用方”為和解少陽(yáng)，瀉熱去實(shí)之劑^[1]。目前尚未發(fā)現(xiàn)柴胡加芒硝湯治療FC的藥理學(xué)研究和臨床應(yīng)用的報(bào)道。但有小柴胡湯及其加減方治療腸道氣滯型FC臨床報(bào)道與研究^[22]，可有效緩解心情焦慮引起肝失疏泄，腸氣不通、糟粕內(nèi)停，大腸傳導(dǎo)失司，即腸道氣滯型FC。《神農(nóng)本草經(jīng)》言柴胡主“腸胃中結(jié)氣，飲食積聚，寒熱邪氣，推陳致新”，說(shuō)明柴胡可促進(jìn)臟腑的新陳代謝，能推動(dòng)少陽(yáng)樞機(jī)，并由此起到調(diào)和表里作用^[23]。半夏、生姜能疏通郁滯，調(diào)理脾胃升降。胃氣以降為順，胃氣不降多由火旺氣實(shí)所致，故予黃芩清火即是降胃氣；脾氣以升為常，故用人參、甘草、大棗益氣，又能推動(dòng)大腸傳導(dǎo)之力^[24]。方中芒硝功效為“瀉下通便、潤(rùn)燥軟堅(jiān)”，服用后在腸道內(nèi)形成高滲鹽溶液，吸附大量水分，擴(kuò)張腸道引起機(jī)械刺激，從而促進(jìn)排便，其導(dǎo)瀉機(jī)制與容積性瀉藥接近^[10]。參考《傷寒論》用法，先服用小柴胡湯去外邪，通暢三焦之郁證，后用柴胡加芒硝湯瀉熱去實(shí)，兼輕通三焦，適用于少陽(yáng)病兼有里實(shí)證或大便不通，苦滿(mǎn)難解之里實(shí)證，或熱入血室如瘧狀，胸腹脹滿(mǎn)，大便不通或堅(jiān)硬者。以疏泄肝氣、通利三焦、順氣通便以達(dá)到清氣上升、濁氣下降、腑氣得通的目的，且攻補(bǔ)兼施，在臨床上應(yīng)用于實(shí)秘或者虛秘均能取得較好的效果。因此由小柴胡湯和柴胡加芒硝湯的先后使用可推測(cè)，柴胡加芒硝湯以調(diào)暢氣機(jī)和瀉里實(shí)熱的治法對(duì)FC進(jìn)行了治療。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討了柴胡加芒硝湯治療FC的成分與作用機(jī)制，預(yù)測(cè)治療相關(guān)成分為柴胡皂苷、黃芩素、人參皂苷、漢黃芩素、槲皮素、β-谷甾醇、α菠菜甾醇等64個(gè)關(guān)鍵成分。預(yù)測(cè)此方對(duì)FC的治療機(jī)制可能是以調(diào)節(jié)氯離子通路、鈣離子通路、興奮性和抑制性的神經(jīng)遞質(zhì)和和G-蛋白偶連受體等幾個(gè)關(guān)鍵的通路，均為臨床FC治療藥物的明確機(jī)制^[10]。其中5-HT是重要的胃腸神經(jīng)遞質(zhì)^[25]，幾個(gè)離子通道和5-HT受體均可通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)改善胃腸動(dòng)力^[26]，文獻(xiàn)研究證實(shí)，預(yù)測(cè)的柴胡加芒硝湯對(duì)FC的治療機(jī)制與部分目前上市產(chǎn)品如魯比前列酮^[27-28]、普蘆卡必利^[29]等藥物作用機(jī)制接近，借此，可確認(rèn)柴胡加芒硝湯對(duì)FC治療的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果有一定的準(zhǔn)確性。另外，此方還可影響花生四烯酸代謝通路和肝臟的細(xì)胞色素P450酶、絡(luò)氨酸蛋白激酶等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)機(jī)體消化、循環(huán)等多個(gè)系統(tǒng)和機(jī)體對(duì)藥物的代謝。說(shuō)明柴胡加芒硝湯對(duì)FC的治療機(jī)制不僅在于調(diào)節(jié)神經(jīng)傳導(dǎo)，還影響了體內(nèi)多種代謝途徑。

傳統(tǒng)方劑對(duì)疾病的辨證論治，是多成分、多靶點(diǎn)，通過(guò)多味中藥的協(xié)調(diào)配合共同實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體功能的調(diào)節(jié)，本研究中篩選得到的柴胡加芒硝湯治療FC的64個(gè)關(guān)鍵化合物，但芒硝作為以瀉熱通便為功效的成分卻不在其中，推測(cè)原因可能是芒硝作為結(jié)晶水礦物通過(guò)吸水增大腸道容積促進(jìn)排便，而不是化合物與靶點(diǎn)的直接作用。另外，也可能因?yàn)閿?shù)據(jù)庫(kù)信息尚不全面，沒(méi)有在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)柴胡芒硝湯成分對(duì)腸道結(jié)腸肌神經(jīng)叢的P物質(zhì)^[30]、抑制神經(jīng)遞質(zhì)的血管活性肽VIP^[16]及調(diào)節(jié)腸道水液靶點(diǎn)- AQP3^[22]等便秘病因機(jī)制的作用，因此，對(duì)所預(yù)測(cè)的關(guān)鍵成分、調(diào)控機(jī)制仍需做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。其調(diào)控機(jī)制與中醫(yī)的“和”法治療中調(diào)暢氣機(jī)、解三焦之郁是否有某種形式的聯(lián)系，也有待進(jìn)一步的驗(yàn)證和研究。

來(lái)  源：吳愷懌，郭  欣，黃娜娜，劉  靜，孫  蓉. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)模式的柴胡加芒硝湯治療便秘的系統(tǒng)功效研究與機(jī)制預(yù)測(cè) [J]. 中草藥, 2019, 50(21): 5170-5177.