前言
microRNA（后方簡稱miRNA）的長度比較短，通常是20nt到24nt長度，因此用常規(guī)的qPCR法很難對其直接定量?，F(xiàn)在常用的對miRNA的定量方法主要有三種，分別為加尾法，莖環(huán)引物法，探針法。這篇筆記主要以mmu-miR-30d-50為例總結(jié)一下這前兩種方法，因為探針法的原理與實驗步驟我以前總結(jié)過。就我自己的看法，這三種方法最根本的原理就是延長miRNA。
莖環(huán)引物法
原理
莖環(huán)引物是一種能夠自身環(huán)化的長引物，它的長度約為45bp。下面是莖環(huán)引物的示意圖：
莖環(huán)引物的使用流程：
第一步：在反轉(zhuǎn)錄過程中，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物（需要自己設(shè)計）與miRNA結(jié)合，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；
第二步：在qPCR過程中，莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，兩條引物與打開莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合，其中一條引物與莖環(huán)引物上的公共序列結(jié)合，另外一條與相應(yīng)的miRNA序列結(jié)合（需要自己設(shè)計），其他的miRNA也可以使用公共引物。
mmu-miR-30d-5p的莖環(huán)引物設(shè)計
第一步，查詢mmu-miR-30d-5p的成熟體序列（5'->3'）如下所示：
將U轉(zhuǎn)換為T，就如下所示：
第二步，設(shè)計莖環(huán)引物，莖環(huán)引物由兩部分構(gòu)成，一部分是通用的序列（通用序列有很多種，這里只列舉一種），如下所示：
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC
另外一部分是針對某個miRNA特定序列，這一部分的序列是6個堿基，我們設(shè)計的是miR-30d-5p，從它的3'端，開始數(shù)取6-8個序列，即GAAGGTCA，取它的互補序列，即為CTTCCAGT，將這段序列與莖環(huán)引物的通用序列，結(jié)合，就成了miR-30d-5p的反轉(zhuǎn)錄引物，如下所示：
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCTTCCAGT
這個引物是在反轉(zhuǎn)錄的時候使用，它在反轉(zhuǎn)錄過程中的示意圖如下所示：
第三步，設(shè)計qPCR引物，正向引物，每個正向引物包括5’端通用序列和3'端miRNA特異序列，5’端通用序列為：5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’，用于延伸實時定量PCR產(chǎn)物的長度；3’端為跟據(jù)成熟miRNA自身堿基組成及GC含量適當(dāng)刪減幾個堿基所得的寡核苷酸或完整的成熟miRNA。即：上游引物為5'-
通用引物+NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ ，自miRNA5’端抄起，14-16個或13-14個，這里就抄14個堿基。
通俗的說就是：保護性堿基（用來調(diào)GC含量的）+miRNA 5
端的13-16個堿基（不要抄到最后那6-8個上去了，意思就是不要與RT那段重疊了），因此miR-30d-5p的qPCR正向引物序列就是：
反向引物，就是莖環(huán)引物上的一段序列，這里直接寫為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'（就是莖環(huán)引物上的一段序列）。這兩條引物在qPCR中的反應(yīng)過程如下所示：
RNA提取的實驗材料
Trizol（Thermo Fisher Scientific）
RNAase-Free水
無水乙醇（重慶川東化工有限公司）
氯仿（成都市科龍化工試劑廠）
異丙醇（成都市科龍化工試劑廠）
qPCR試劑盒（Takara，貨號：RR820A）
反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，貨號：RR037A）
qPCR實驗過程
1.提取RNA
提取RNA，按照常規(guī)的Trizol法提取即可，最終提取并測完濃度后，將RNA樣本稀釋到300ng/uL的濃度，并分裝到3個EP管中，并取一部分出來，進行質(zhì)控。質(zhì)控的內(nèi)容包括：1.2%的瓊脂糖電泳，電壓120V，40分鐘，上樣量200ng。
2. 反轉(zhuǎn)錄
-
反轉(zhuǎn)錄采用Takara的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，這個試劑盒是常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，在反轉(zhuǎn)錄miRNA的時候，不需要試劑盒里面的2個引物，即成分3（Oligo
dT primer）和成分4（Random 6
mers），使用自己設(shè)計的莖環(huán)引物進行反轉(zhuǎn)，反轉(zhuǎn)體系如下所示（20μL體系）：
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成分 |
體積 |
|
5XPrimeScript Buffer |
4 |
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PrimeScript RT Enzyme Mix
I |
1 |
|
莖環(huán)引物 |
1 |
|
總RNA |
1 |
|
無RNAase水 |
20μL |
PCR程序為：
- Step 1：37, 15min
- Step 2：85 , 5 sec
- Step 3：4 , 5min
3. qPCR反應(yīng)
反應(yīng)體系如下所示：
|
組分 |
體積(μL) |
|
2×SsoAdvanced SYBR Green
Supermix |
10 |
|
Forward Primer(10μM) |
1 |
|
Reverse Primer(10μM) |
1 |
|
cDNA Template |
1 |
|
ddH2O |
To 20μL |
(2)PCR反應(yīng)條件：
第一步：預(yù)變性條件95/10s；1 cycle；
第二步：PCR反應(yīng)條件95/5s，60/30s，70/20s；40 cycles；
第三步：融解曲線分析95 0s，20/s，65 15s，20/s ，95 0s ，0.1/s。
分析數(shù)據(jù)即可。
莖環(huán)引物法的優(yōu)缺點
莖環(huán)引物法的優(yōu)點就在于特異性強，成本低。缺點就是一次只能針對一種特定的miRNA進行檢測，而加尾法則能夠?qū)iRNA進行批量篩選。
加尾法
原理
加尾法的根本原理也是延長miRNA，然后再用上下游引物來進行qPCR。
在這里，還以miR-30d-5p為例，以及Takara的一個miRNA試劑盒為例說明一下加尾法的原理，參考資料主要是該試劑盒的說明書，即Mir-X™
miRNA First-Strand Synthesis and SYBR® qRT-PCR User
Manual。這個試劑盒里面有這些成分：mRQ Enzyme Mix；mRQ Buffer (2X)；mRQ 3’ Primer
(10 μM) ；U6 Forward Primer (10 μM)；U6 Reverse Primer (10
μM)。
其中，mRQ Enzyme Mix中含有poly(A)聚合酶，該酶向miRNA的3'末端添加poly(A)尾，此外還含有SMART
MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，這個酶主要用于將加了poly(A)的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。mRQ buffer是緩沖液，很好理解；mRA 3'
Primer這個我猜測可能是進行qPCR反應(yīng)時的公共引物；與是U6的內(nèi)參，這個也好理解。
整個反轉(zhuǎn)錄過程如下所示：
以上就是加尾法對miRNA進行檢測的原理。這里只是以mmu-miR-30d-5p為例說明了一下，其實它也可以是miR-770-5p，也可以是miR-21-3p等，一次反轉(zhuǎn)錄幾乎能夠把細胞內(nèi)的所有miRNA都給反轉(zhuǎn)錄成cDNA。因此，如果批量對miRNA進行qPCR篩選的話，加尾法是一種比較合適的方法，它只需要設(shè)計針對某個miRNA的特異引物即可，這樣一次反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA就可以重復(fù)做多個miRNA的檢測。
加尾法的上游引物設(shè)計
從原理圖上可以知，例如針對miR-30d-5p的引物其實就是miR-30d-5p序列本身，只是把U變成了T。例如miR-30d-5p的成熟體序列為UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG，那么它的加尾法上游引物就是TGTAAACATCCCCGACTGGAAG。
qPCR反應(yīng)
加尾法的qPCR反應(yīng)體系跟普通的qPCR體系一樣，程序也類似（如果一次篩選大量的miRNA，則需要優(yōu)化一下退火溫度）。
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