2015版《中國藥典》將于今年12月1日開始實(shí)施，關(guān)于微生物的部分，改變確實(shí)是比較大的，特別是非無菌產(chǎn)品的微生物限度檢查法，從培養(yǎng)基，方法適用性以及培養(yǎng)的條件等都有改變，針對這些改變，筆者想分開，每個(gè)步驟從細(xì)節(jié)上去剖析具體怎么做，所以會(huì)寫一個(gè)系列的介紹，這次先從非無菌產(chǎn)品微生物計(jì)數(shù)方法適用性開始寫，算是我的一點(diǎn)拙見，供大家參考。

一、計(jì)數(shù)方法

新版藥典的非無菌產(chǎn)品微生物計(jì)數(shù)方法為平皿法、薄膜過濾法和MPN（Most Probable-Number Method）法；其中，MPN法是今年新加入的方法，它的特點(diǎn)是用于微生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，此法不適合用于檢測酵母菌和霉菌，所以我們今天就不談?wù)撨@種方法；薄膜過濾法在實(shí)施時(shí)需要增加薄膜過濾器等設(shè)備，操作相對較復(fù)雜，所以一般在實(shí)際工作中，除非是藥品的抑菌作用較強(qiáng)，否則一般不會(huì)使用這種方法，所以我們就以使用最廣泛的平皿法為例來進(jìn)行說明。

二、微生物限度計(jì)數(shù)法——平皿法方法適用性

1、試驗(yàn)用菌的制備

取相應(yīng)菌，放相應(yīng)的培養(yǎng)基，適合的條件培養(yǎng)合適的時(shí)間，具體見表一

表一：

備注：所有的菌，除了黑曲霉菌懸液可以存放在2-8℃，在驗(yàn)證的時(shí)間內(nèi)使用之外，所有的菌均需要使用新鮮的菌。

2、菌懸液的制備

將表一的菌種的新鮮培養(yǎng)物，細(xì)菌用接種環(huán)，取少許加入到10ml的無菌0.9%NaCl溶液中（如培養(yǎng)與TSB中，可使用移液器取1ml加到9ml 無菌0.9%NaCl溶液中），按照10倍逐級稀釋，計(jì)數(shù)，備用。（這部分需要摸索，所以一般要菌落計(jì)數(shù)時(shí)，要做2-3個(gè)稀釋級，保證最后實(shí)驗(yàn)的成功）。

霉菌：取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入3～5ml 含0.05％聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，混勻，使用含0.05％聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液進(jìn)行10倍逐級稀釋，備用；

白色念珠菌：取10ml的無菌0.9%NaCl溶液，全部加入到接種有白色念珠菌的斜面試管中，使用接種環(huán)，將菌全部刮下來，混勻，使用無菌0.9%NaCl溶液進(jìn)行逐級稀釋，備用。

3、供試液的制備

供試液的制備因?yàn)闆]有改變，所以按照公司原先的方法來進(jìn)行制備，這里不進(jìn)行贅述。

4、試驗(yàn)程序

1） 試驗(yàn)組：取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每1ml供試液中含菌量不大于100cfu。這里要注意，菌液是加入到供試液中，一般的供試液制備是100ml，藥典規(guī)定，加入菌液的體積不應(yīng)超過供試液體積的1%，也就是說，通常情況下，不但要使得100ml中的供試液中的每ml的供試液中含菌量不大于100CFU，加的菌液的總體積還不能超過1ml，這個(gè)和2010版《中國藥典》有很大的改變，所以在操作上要特別注意，在加菌的過程中，需要進(jìn)行一個(gè)換算，比如菌液在菌落計(jì)數(shù)時(shí)10-6這個(gè)稀釋級1ml菌落數(shù)是在30-100CFU之間，那么加入菌液的稀釋級就應(yīng)該是10-4，才能使得100ml的供試液中，每1ml的菌的含量不超過100CFU。將加好菌液的供試液混勻，取1ml到90mm平皿中，傾注45-50℃的培養(yǎng)基，用手輕搖使供試液和培養(yǎng)基充分混合，細(xì)菌使用TSA，培養(yǎng)時(shí)間不超過3天; 霉菌和酵母菌于20-25℃培養(yǎng), 培養(yǎng)時(shí)間不超過5天。計(jì)數(shù)。

2） 供試品對照組：取制備好的供試液，不加入菌液按照試驗(yàn)組同法操作，，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在 30～35℃培養(yǎng)3～5 天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在20～25℃培養(yǎng)5～7 天，查看菌落數(shù)。作為供試品對照組。

3） 菌液對照組：取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

4） 計(jì)算回收率：

5） 回收率標(biāo)準(zhǔn)

每種菌的回收率在50%-200%之間。

5、抗菌活性的去除或滅活

抗菌活性的去除或滅活的方法有以下幾種方法

1） 增加稀釋液或培養(yǎng)基體積：增加稀釋液法和擴(kuò)大稀釋倍數(shù)法有本質(zhì)上的區(qū)別，擴(kuò)大稀釋倍數(shù)法是單純的按照一定的稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，供試液的取樣量是一樣的，但是擴(kuò)大稀釋液法，需要對供試液的取樣量做相應(yīng)的調(diào)整，同時(shí)使用的培養(yǎng)基也要相應(yīng)調(diào)整，這和2010版的培養(yǎng)基稀釋法有區(qū)別的。但筆者認(rèn)為，培養(yǎng)基稀釋法是可行的，如果確實(shí)擴(kuò)大稀釋液和培養(yǎng)基體積法無法消除抑菌作用，還是可以進(jìn)一步結(jié)合培養(yǎng)基稀釋法來做的。

2） 其他方法與2010版一致，這里就不多贅述了。

6、可接受標(biāo)準(zhǔn)：

計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過濾法或時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)0.5～2 范圍內(nèi)；若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。

方法適用性確認(rèn)時(shí),若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求,那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。

值得注意的是，與2010版不同的是未規(guī)定需要進(jìn)行三次的獨(dú)立試驗(yàn)，并且三次試驗(yàn)中的各株菌的回收率都達(dá)到要求，才判定通過；所以可以根據(jù)情況，無需再強(qiáng)制要求每種產(chǎn)品都進(jìn)行三次獨(dú)立試驗(yàn)，因?yàn)閺亩x上來說，我們進(jìn)行的是方法適用性，是對已經(jīng)經(jīng)過驗(yàn)證的方法的確認(rèn)，而不是新方法的驗(yàn)證。