瘤內(nèi)注射STING激動劑能直接激活腫瘤浸潤抗原遞呈細胞(APCs) ，可使治療后的淋巴瘤消退。由于STINGa激活在體外誘導淋巴瘤細胞凋亡，研究人員將STINGa（STING激動劑）在體內(nèi)的直接治療和間接免疫治療特性進行了區(qū)分。采用攜帶野生型或STING敲除腫瘤細胞的野生型或STING敲除宿主，團隊證明局部腫瘤消退完全依賴于宿主的STING表達，由免疫介導。然而，在將STINGa注射到單個腫瘤部位后，遠處未治療的腫瘤僅受到輕微影響。據(jù)此，利用目前正在進行臨床試驗的STINGa，我們篩選了能夠與STING通路協(xié)同作用的免疫調(diào)節(jié)劑，誘導全身抗腫瘤免疫反應，使遠處腫瘤消退。研究人員將STINGa與改善APC或T細胞功能的藥物聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)APCs和T細胞的調(diào)節(jié)都可以通過STINGa增強對遠處淋巴瘤的控制，特別是，添加抗GITR抗體可導致淋巴細胞在引流治療部位的淋巴結(jié)內(nèi)擴張，然后在遠處腫瘤中增加T細胞浸潤。此外，更多的CD8 T細胞在遠處表達PD-1。因此，阻斷PD-1可進一步增強腫瘤遠端控制，使50%的小鼠治愈。這些臨床前數(shù)據(jù)為局部注射STINGa、隨后使用激動劑抗GITR和抗PD-1抗體作為人類淋巴瘤的免疫治療提供了依據(jù)。

Figure 1. STING toxicity on lymphoma vs immunotherapeutic effect.

圖1 STING對淋巴瘤的毒性與免疫治療效果對比

圖1A：我們使用CRISPR Cas9敲除了BL3750 B細胞淋巴瘤系中的STING。

圖1B：正如所料，STING KO克隆在體外對STINGa(20 mg/mL)刺激具有抗性。

圖1C：為了評估STINGa作為原位疫苗的直接毒性作用，研究人員將WT或STING KO淋巴瘤細胞植入WT或STING KO小鼠中。每只小鼠植入兩個腫瘤，腹部每側(cè)1個。在腫瘤植入后第6,8和10天，將20mg STINGa或NS注入1個腫瘤并監(jiān)測兩個部位以評估局部和遠處的影響（每組5-10只小鼠） 。

 1、STINGa治療對攜帶STING KO腫瘤的STING KO小鼠沒有影響。

2、在攜帶WT腫瘤的STING KO小鼠中，我們觀察到與載體處理的小鼠相比，注射的腫瘤的生長暫時受損并且在遠處位點延遲腫瘤生長。

3、在攜帶STING KO腫瘤的WT小鼠中，治療側(cè)腫瘤消失，引起壞死的黑色瘢痕。此外，該療法延緩了遠處腫瘤的生長。

總結(jié)：這些數(shù)據(jù)顯示注射的腫瘤的清除和WT小鼠中的全身抗腫瘤作用獨立于腫瘤上的STING表達，但需要宿主中的STING表達。

Figure 2. STING in situ vaccination is improved when combined with CpG, anti-OX40, or anti-GITR.

圖2當與CpG，抗OX40或抗GITR組合時，STING原位疫苗接種得到改善。

圖2A：每只小鼠植入兩個腫瘤（5*106），腹部每側(cè)1個。在腫瘤植入后第6,8和10天，將5mg STINGa瘤內(nèi)注射（IT）和其他聯(lián)合藥物注入1個腫瘤并監(jiān)測兩個部位以評估局部和遠處的影響。

圖2B: 5 mg STINGa、5 mg CpG 瘤內(nèi)組合干預，能引起遠隔效應，增強STING原位疫苗接種。

圖2C: 5 mg STINGa瘤內(nèi)注射、 8 mg anti-OX40抗體遠處皮下注射，能引起遠隔效應，增強STING原位疫苗接種。

圖2D: 5 mg STINGa瘤內(nèi)注射、50 mg anti-GITR抗體遠處皮下注射，能引起遠隔效應，增強STING原位疫苗接種。

圖2E: 5 mg STINGa、5 mg Resiquimod 瘤內(nèi)組合干預，能引起遠隔效應，增強STING原位疫苗接種。

總結(jié): anti-OX40, anti-GITR, CpG, and Resiquimod：協(xié)同

         anti-CD47, anti-TIGIT, IDO inhibitors：無或者抑制

      因為STINGa和anti-GITR都是在臨床試驗中單獨測試的，研究人員認為這兩種藥物的組合最終在臨床測試中是合乎邏輯的。因此，決定進一步研究這種特殊的組合。

         為了優(yōu)化治療，研究人員測試了不同的注射途徑《IT、腫瘤周圍（PT）、遠處部位皮下注射（SC）》，也評估了其他腫瘤模型的治療。（圖3）

附圖3：治療的局部或全身遞送以及治療在其他腫瘤模型中的效果。

如圖所示：STINGa必須局部注射，但不一定注入腫瘤以誘導全身效應。

1、 IT和PT注射STINGa引起的全身效應相似，而當在遠處皮下施用STINGa時，主要效果喪失。然而，IT和PT注射的局部效應是不同的; PT注射顯著減少了局部腫瘤的生長，但沒有清除它，而IT注射使腫瘤變成瘢痕并清除它。

2、當STINGa PT或遠處部位SC時未觀察到瘢痕。

3、PT注射也起作用的事實表明STINGa靶向局部引流淋巴結(jié)中的APC以誘導全身性抗腫瘤作用。

圖3.全身性抗腫瘤反應是T細胞介導的。

圖3A: 為了評估T細胞及其亞組在組合中的作用，研究人員使用合適的單克隆抗體從宿主中去除CD4 +，CD8 +或兩個亞組。在不同組中比較注射部位和遠處部位的腫瘤生長。消除CD8+T細胞的消耗損害了組合在治療和遠處部位的治療效果。然而，CD4  +細胞的消耗不影響局部和全身抗腫瘤作用。

圖3B-3D: 在第6天，第8天和第10天，用瘤內(nèi)注射STINGa和/或皮下注射抗GITR處理小鼠。在第17天，收獲脾臟。在用腫瘤細胞（A20）或不相關的腫瘤細胞（4T1）再刺激后監(jiān)測產(chǎn)生INF-g的細胞。用A20細胞再次刺激仍可誘導CD4 +，CD8+ T細胞擴增，而4T1則無反應。

圖3E：在瘤內(nèi)注射STINGa或NS后2和4小時收獲經(jīng)處理的腫瘤。發(fā)現(xiàn)與NS治療的腫瘤相比，CD8+和CD4 +T細胞的總百分比沒有變化。然而，注意到STINGa處理的腫瘤中CD4+FoxP3+Tregs細胞的百分比較低。

小結(jié)：局部和全身抗腫瘤反應需要CD8+T細胞，且 T細胞應答具有特異性，另外，腫瘤浸潤性Treg可能在STINGa處理后失去FoxP3表達。

為了了解STINGa和抗GITR之間治療協(xié)同作用的免疫機制，研究人員通過流式細胞術分析了治療腫瘤的引流淋巴結(jié)和遠處腫瘤浸潤細胞。如圖4A所示，我們將分析重點放在2點上： 在最后一次注射后1天，就在遠處腫瘤開始響應之前，并且在最后一次注射后1周，當遠處腫瘤已經(jīng)退化時。

Figure 4. Dissection of the immune response in the nontreated tumor.

圖4.未治療腫瘤中免疫應答的剖析。

圖4B: 在遠處腫瘤中，T細胞浸潤在治療后1周增加。

圖4E-I:在遠處腫瘤中，組合治療早在治療后1天就增加CD8 T細胞活化，如CD8 T細胞中ICOS 1，Ki67 1和CD69 1細胞的百分比更高所示。此外，表達低水平PD-1的細胞百分比在處理后1周更高。

Figure 5. Dissection of the immune response in the draining lymph node of the treated tumor.

圖5.處理的腫瘤的引流淋巴結(jié)中的免疫應答的解剖。

圖5A-5B:在治療后一天，治療組中的引流淋巴結(jié)的大小更加突出，并且含有比對照組多3至5倍的細胞?？笹ITR治療誘導更大百分比的APC（CD11b），而STINGa增加活化的APC的比例（CD86）。聯(lián)合治療增加T細胞活化和增殖。

圖5C-5E:治療組：聯(lián)合治療增加T細胞活化和增殖。治療后一天組合治療的淋巴結(jié)在CD3 細胞中具有增加的CD8 T細胞比例，這導致CD8 / Treg比率增加。

圖5F-I:，聯(lián)合治療與CD8 T細胞活化增加相關，如表達CD69，Ki67和ICOS的細胞百分比較高，PD-1表達上調(diào)。

總結(jié)圖4圖5：根據(jù)結(jié)果所示，似乎在治療的腫瘤的引流淋巴結(jié)中開始免疫應答。然后，它擴散到遠處的腫瘤。在淋巴結(jié)中，治療后1天比治療后1周有更多活化細胞，而遠端腫瘤則觀察到相反的情況，并且遠處免疫細胞PD-1表達的增加也為了免疫治療造勢?？傊@些數(shù)據(jù)表明，聯(lián)合治療可誘導T細胞活化和擴張，這是由治療腫瘤引流淋巴結(jié)中活化的APCs數(shù)量較多引起的。

腫瘤引流淋巴結(jié)流式細胞術分析顯示，治療后1周免疫反應減弱。因此，團隊研究延長治療時間是否能延長抗腫瘤反應，從而增強全身效果。

Figure 6. Expending in situ vaccination in a second treated site improve the treatment.

圖6.在第二個處理部位進行延長原位接種疫苗療程可改善治療效果。

圖6A-6B：雙瘤建模同fig 1C。分為兩組，一組為一輪療程組（3針），另一組為三輪療程組（9針）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)將治療延長到3個周期并沒有改善遠處的結(jié)果。

針對此結(jié)果，研究人員分析：在第一輪治療后，注射的腫瘤消失并變成瘢痕。因此，對于第二輪STING疫苗接種，在治療部位沒有更多的腫瘤抗原可用。據(jù)此研究人員假設在第二周期期間具有用于注射STINGa的額外腫瘤部位將改善結(jié)果。

為了驗證這一假設，我研究人員在小鼠腹部植入了3個A20腫瘤（具體方法同前）。分為兩組，一組為一個腫瘤干預組，另一組為兩個腫瘤干預組。

圖6C-6D：在該方案中，與僅接受1個治療周期的小鼠相比，第三個位點的腫瘤生長在接受2個連續(xù)治療周期的小鼠中顯示出更高的生長延遲。此外，處理2個周期的小鼠比僅處理1個周期的小鼠存活顯著更長。

結(jié)論：從這些數(shù)據(jù)中，我們可以得出結(jié)論，STINGa的抗腫瘤作用可以通過重復循環(huán)（即IT注射不同部位）來延長。

在STINGa和抗GITR治療后，可以觀察到局部淋巴結(jié)和遠處腫瘤中PD-1表達細胞的增加。因此，研究人員繼續(xù)評估了PD-1阻斷的加入是否可以增強我們的治療效果。

Figure 7. PD-1 blockade improve STING 1 anti-GITR therapy.

圖7. PD-1阻斷改善了STINGa聯(lián)合抗GITR的治療效果。

結(jié)論：如圖所示，與任何雙重組合相比，三聯(lián)組合顯示遠處位點的腫瘤控制得到改善，三療法的存活率也有所改善。

討論：該研究團隊已經(jīng)證明注射腫瘤的清除完全取決于宿主細胞中的STING活化，并且STINGa對淋巴瘤細胞的直接毒性僅具有較小的影響，而且治療部位的腫瘤消退是T細胞介導的，其與治療腫瘤中CD4 +  FoxP3 + T細胞的早期減少有關。

  在篩選可以增強STING原位疫苗接種的化合物時，團隊測試了APC刺激劑(抗CD47，CpG和Resiquimod)和T細胞調(diào)節(jié)劑(anti-OX40，抗GITR，抗TIGIT和IDO抑制劑)。其中，CpG，Resiquimod，抗OX40和抗GITR顯示出功效，表明調(diào)節(jié)APC或T細胞可以增強STING原位疫苗接種(治療過的和遠處的腫瘤以及引流淋巴結(jié)。

  STINGa和GITR調(diào)節(jié)的組合刺激了局部和全身T細胞反應。文章數(shù)據(jù)表明，STINGa在治療部位的引流淋巴結(jié)中激活了APC，與GITR共刺激一起誘導了該淋巴結(jié)中T細胞和B細胞的活化和增殖。然后，活化的T細胞從該淋巴結(jié)遷移到遠處的腫瘤并攻擊腫瘤細胞，導致腫瘤消退。然而，在遠處腫瘤部位，這些活化的T細胞很快被T細胞上表達的PD-1和腫瘤細胞上表達的PD-L1之間的相互作用所抑制。用STINGa和抗GITR的組合治療的小鼠具有較高比例的PD-1low CD8  T細胞。該細胞亞群顯示為對PD-1阻斷有反應的。使用抗PD-1抗體阻斷PD-1 / PD-L1相互作用能夠增強STINGa和抗GITR組合的治療效果，并治愈一半的老鼠。

  因此， STING原位疫苗聯(lián)合GITR和PD-1調(diào)節(jié)是一種很有前景的淋巴瘤治療方法。腫瘤內(nèi)注射STINGa會引起局部毒性，但這可以通過腫瘤周圍注射來避免。

About us：

格源致善是一家以個性化腫瘤疫苗的研究和應用為核心的生物醫(yī)學科研公司，始終聚焦于個性化腫瘤疫苗的臨床治療研究、新抗原預測和標準化評估體系的建立。