原文鏈接（https://www./method/Western-Blot-Protocol-Troubleshootings-and-Survey-Results-on-Instruments-and-Reagents.html）

主要內(nèi)容：文章詳細描述了Western印跡相關儀器和試劑的比對結果，例如ECL發(fā)光信號檢測試劑盒，凝膠制劑和預制凝膠，以及轉移膜，數(shù)據(jù)來源于551個正式發(fā)表的Western印跡。 文章提供了典型的Western印跡方案，并討論了Western印跡過程中的常見問題。

典型的Western印跡方案：

試劑和緩沖液：

1x RIPA緩沖液：50mMTris，150mMNaCl，0.1%SDS，0.5%脫氧膽酸鈉，1%Triton X-100或NP40。

1x PBS緩沖液：137mMNaCl，2.7mMKCl，2.7mM Na₂HPO4,2.7mM KH₂PO₄，pH7.4

BCA蛋白質測定試劑盒或Bradford蛋白質測定試劑盒

1.5MTris緩沖液（pH8.8）：90.68gTris-HCl至ddH2O，用HCl調(diào)節(jié)pH至8.8至最終500ml

1.0 M Tris緩沖液（pH6.8）：60.58gTris-HCl至ddH2O，用HCl調(diào)節(jié)pH至6.8至最終500ml

10%APS：在1ml ddH2O中的100mgAP。使用前準備好。

10%SDS：在100ml ddH2O中的10g SDS。

1xTris-甘氨酸緩沖液：25mM Tris，230mM甘氨酸（pH8.3），0.1%SDS。

3xSDS蛋白上樣緩沖液：150mMTris（pH 6.8），6%SDS，30%甘油，30mM EDTA和0.2%溴酚藍。緩沖液應該是新鮮制備，分裝后4℃保存。

1x TTBS：25mMTris（pH 7.5）：0.15MNaCl，0.05%Tween-20,0.001%硫柳汞

1x轉移緩沖液：3gTris，14.4g甘氨酸和200ml甲醇，將ddH2O加入1L

樣品制備：

來自細胞培養(yǎng)的樣品

貼壁細胞除去上清液，用1X PBS洗滌，除去殘留的培養(yǎng)基。

加入預先冷的400ul-1ml 1X RIPA緩沖液/ 100mm培養(yǎng)皿。 在冰上孵育5-10分鐘。

完全刮擦細胞并轉移到冰上預先冷卻的1.5ml微管中。

（可選）徹底均化或超聲處理。

在12,000rpm，4℃下離心10-15分鐘，收集上清液備用。

總蛋白應儲存在-80°C備用。

組織

組織制備和定量。 將它們切成小塊。

添加約500-600ul預冷的1x RIPA緩沖液/ 100mg組織。徹底均化組織。在12000rpm，4℃下離心15-20分鐘。

蛋白質定量

Bradford測定和BCA測定。

SDS-PAGE

聚丙烯酰胺凝膠制劑

在頂部用堆積凝膠（5％）和凝膠梳（10或15個孔）制備6％-15％的分離凝膠。

樣品加載和電泳將2X SDS蛋白上樣緩沖液與蛋白質樣品以1：1的比例徹底混合。

在加載凝膠之前，將樣品在50-60℃預熱。 預染色的分子量標記物用于監(jiān)測蛋白質分離和蛋白質轉移效率。在1X Tris-甘氨酸緩沖液中以60-120V運行凝膠1-3小時。

蛋白質轉移

將蛋白質轉移至PVDF或NC *膜用于抗體檢測。

在1X轉移緩沖液中預先潤濕材料，如凝膠，Whatman紙和海綿。

PVDF膜應在甲醇中孵育10s-1min，然后移動到1X轉移緩沖區(qū)。

堆放材料如下：表殼（黑色邊），海綿，Whatman紙，凝膠，膜，Whatman紙，海綿，表殼（透明面）。放置在黑色面朝黑的轉印裝置中。使用冷的1X轉移緩沖液在冷卻環(huán)境中轉移。 應根據(jù)印跡系統(tǒng)制造商的建議優(yōu)化轉移電流和時間。

*切勿將NC膜與甲醇一起孵育。

將溶解在1x TBST中的5%脫脂牛奶中的膜在25℃下封閉1小時（或在4℃下在振蕩器上過夜）。與抗體孵育在推薦稀釋度下用1X TBST + 3％BSA稀釋的一抗或根據(jù)結果優(yōu)化稀釋。在4°C孵育過夜或更長時間或在室溫下孵育4小時。

回收第一抗體并在4°C下儲存。 然后在室溫下在振蕩器上將膜洗滌3X 5-10分鐘。

在1X TBST中稀釋第二抗體并將膜在室溫下孵育1小時或在4℃下在搖床上孵育2-4小時。在室溫下在振蕩器上在TBST中洗滌3X 10分鐘。

ECL +系統(tǒng)和X射線膠片用于HRP綴合的二抗。

問題與解決辦法

1.問題：我打算對擬南芥自噬蛋白中的天然蛋白進行Western Blot。目的蛋白質和參考基因（Tubulin）同時檢測。還是在兩個不同時間對蛋白進行印跡，用Tubulin洗滌后再洗滌二次HRP抗體？另外，我想檢測自噬天然3/4蛋白的表達，我可以在一個膜上進行所有嗎？

答：您不應該嘗試同時檢測所有蛋白質。在使用第二種一抗之前，您應該去除一抗和二抗。即，用針對您感興趣的蛋白質的第一抗體和第二抗體進行印跡，用ECL檢測，然后用剝離緩沖液剝離一抗和二抗，然后用微管蛋白抗體及其二抗進行印跡，并檢測。在剝離過程中，PVDF膜通常比硝酸纖維素膜更好地保留蛋白質。 PVDF膜的供應商應為您提供有關剝離緩沖液（溫和或苛刻）和方案的信息。您應該能夠執(zhí)行幾次印跡/剝離循環(huán)（一般最多三次）。每次在印跡之前，您可以使用Ponseau S染色檢查印跡，以便在您不確定時可視化樣品蛋白質。請注意，由于剝離，印跡上的樣品蛋白會丟失。

沒有信號，可能的原因：

用于檢測的錯二抗。 （確保一抗的宿主）

低濃度的一抗/二抗。 （提高濃度再試一次）

一抗不識別被檢測物種中的蛋白質。（檢查一抗的特異性）

加在凝膠上的蛋白質量太少。 （增加樣本量）

轉移效率很低。 （修改轉移程序的操作。確保PVDF與甲醇預孵育。轉移后干燥PVDF以確保蛋白質與疏水膜的結合）

一抗已被使用過多次。 （使用新稀釋的一抗）

阻塞時間太長或洗太多次。 （減少堵塞時間和洗滌時間）

檢測套件不起作用。 （使用陽性對照并確保檢測試劑盒正常工作）

疊氮化鈉可以抑制二抗。 （避免在稀釋緩沖液中使用疊氮化鈉）

與一抗或二抗的孵育時間太短。 （延長孵化時間）

SDS加載緩沖區(qū)可能已過期。 （使用新制備的SDS上樣緩沖液）

SDS上樣緩沖液和樣品裂解液混合均勻。 （劇烈渦旋）

高背景：

阻塞時間太短或使用阻塞緩沖液錯誤（延長阻斷時間或用BSA替代脫脂牛奶，或制作鮮奶溶液）。使用BSA，脫脂脫脂乳，偶爾使用來自山羊或兔等的全血清來預孵育膜，以使膜上的任何非特異性結合空間飽和。一旦非特異性結合空間飽和，第一抗體將僅結合特異性抗原。 BSA含有一種蛋白質，白蛋白。牛奶含有數(shù)百種蛋白質，酪蛋白是其主要成分，因此可以阻斷所有潛在的非特異性結合位點。因此，牛奶優(yōu)于BSA，也更便宜。大多數(shù)一抗不太可能與白蛋白或酪蛋白發(fā)生交叉反應。如果任何沒有蛋白質的區(qū)域具有高背景，則阻塞步驟可能無法正常工作。

高濃度的一抗/二抗。 （降低抗體濃度）

洗滌不足。 （增加洗滌次數(shù)）

孵化溫度太高。 （確保一抗在4°C孵育）

錯誤的膜或膜干燥了一段時間。 （防止膜干燥）

較高分子量的高背景可能表明還原劑/ SDS /樣品加熱未正確完成。

非特異性信號

高濃度的一抗/二抗。 （降低抗體濃度）

內(nèi)源性免疫球蛋白，特別是在組織裂解液中[2]。如果沒有一抗的對照運行，該信號應該持續(xù)。用例如蛋白G瓊脂糖預先清除內(nèi)源性免疫球蛋白，使用專門的二抗如TruBlot，或加熱等其他治療可以幫助減少來自內(nèi)源性免疫球蛋白的非特異性信號[2]。

臟兮兮或模糊的樂隊

凝膠的平衡時間不足或凝膠與膜之間的接觸不均勻。 （確保凝膠沒問題并改善轉移程序）

禿頭斑點

凝膠和膜之間的氣泡。 （確保凝膠和膜之間沒有氣泡）

帶尺寸與理論重量不一致

抗體特異性差。 （改變一抗）

一些蛋白質的遷移可能與其理論重量完全不同。

未能揭示可能的翻譯后修改

通過SDS-PAGE無法解析向蛋白質分子引入負電荷的翻譯后修飾，如聚（ADP-核糖基 - PAR鏈）[3]。然而，它們可以通過CTAB-PAGE分離揭示[3]。 CTAB，西曲溴銨（（C16H33）N（CH3）3Br，十六烷基三甲基溴化銨，十六烷基三甲基溴化銨）是胺類陽離子季銨表面活性劑。

溴化一銨（monium bromide），是一種胺基陽離子季銨鹽表面活性劑。

Labome對Western blot相關儀器和試劑的調(diào)查

Labome調(diào)查文獻以了解試劑和儀器的常見用法。

信號檢測

化學發(fā)光是Western印跡中常用的信號檢測方法。表1列出了主要供應商及其主要品牌，以及Labome調(diào)查的正式出版物中的引用次數(shù)。 GE Healthcare及其各種Amersham ECL試劑盒和Thermo Fisher Pierce SuperSignal West試劑盒主導了這種Western印跡試劑的提供。 GE Healthcare Amersham ECL試劑（Plus最常被引用。注意：自2014年10月4日起，GE醫(yī)療集團已停止使用Plus;當前版本為Prime）用于研究果蠅中CK2激酶的功能特性[4] ，Vav2和Vav3在皮膚癌中的作用[5]，白藜蘆醇對肌肉中線粒體生物合成的影響[6]，Erf2在蛋白質棕櫚酰化中的調(diào)節(jié)作用和粟酒裂殖酵母的減數(shù)分裂[7]，sFLT-的作用1維持小鼠模型中的無血管光感受器層[8]，α-突觸核蛋白在突觸囊泡模擬聚類中的作用[9]，信息素配體[10]，FGF21在延長小鼠壽命中的作用[11] ]，在脊索動物胚胎中建立尖銳的邊界[12]，以及轉錄終止的調(diào)節(jié)[13]。截至2014年10月，GE Healthcare提供三種版本的ECL套件：常規(guī)ECL，Prime和Select，基于敏感性和信號持續(xù)時間。圖1列出了GE Healthecare的選擇指南。

預制凝膠

SDS-PAGE中使用的凝膠可以由丙烯酰胺和其他化學品新鮮制成，或者可以使用來自商業(yè)供應商的預制凝膠。 Life Tech和Bio-Rad是預制凝膠的兩個主要供應商（表2）。 Life Technologies NuPAGE Novex Bis-Tris預制凝膠（大多數(shù)為4-12％）用于研究果蠅中CK2激酶的功能特性[4]等[14,24]。 Life Technologies NuPAGE Novex 3-8％Tris-醋酸酯凝膠用于研究果蠅中CK2激酶的功能特性[4]和Wnt /β-連環(huán)蛋白信號傳導對端粒酶的調(diào)節(jié)[25]。 為了研究caveolar coat complex的結構組成，采用了Invitrogen公司的NuPAGE 4-20％Tris / Glycine gel進行免疫印跡實驗[24]。 Bio-Rad 4-15％SDS-PAGE凝膠（目錄號5671084）用于研究連接[26]。

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