多肽的結構分析方法：質譜、核磁共振、紅外光譜、紫外光譜、圓二色譜、X射線晶體學

太行郎中 2019-05-22

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由氨基酸組成的多肽數(shù)目驚人，情況十分復雜，由100個氨基酸聚合成線形分子，可能形成20100種多肽。僅由Gly、Val、Leu三種氨基酸就可組成六種三肽。因此，多肽結構的確定，尤其是長鏈多肽結構的確定是一個相當重要也相當復雜的工作。純的、單一的多肽是保證肽結構確證的前提條件。杭州專肽生物可對多肽提供1-5種檢測報告。

多肽的結構分析方法

(一) 質譜

經(jīng)典的多肽測序方法包括N末端序列測定的化學方法，如 Edman法、C末端酶解方法及C末端化學降解法等，這些方法都存在一定缺陷。例如作為多肽和蛋白質序列測定標準方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯( phenylisothiocyanate，PITC)分析法(即 Edman法，又稱PTH法)，測序速度較慢(每天50個氨基酸殘基)；樣品用量較大(nmol級或幾十pmol級)；對樣品純度要求很高；對修飾氨基酸殘基往往會產(chǎn)生錯誤識別，而對N末端保護的肽鏈則無法測序。C末端化學降解測序法則由于無法找到PITC這樣理想的化學探針，仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質譜( mass spectrometry，MS)由于具有較高的靈敏度、準確性、易操作性而備受關MS用于多肽序列測定時，靈敏度及準確性隨分子量增大而明顯降低，所以采用MS進行多肽序列分析比蛋白質簡單，許多研究均是以多肽作為分析對象。近年來隨著電噴霧電離質譜( electrospray ionisation，ES)及基質輔助激光解吸質譜( matrix assisted laser desorption/ Ionization，MALD)等質譜軟電離技術的發(fā)展與完善，使極性大分子多肽的分析成為可能，檢測限可達fmol級，可測定的分子量范圍則高達100kDa。目前MALD已成為測定生物大分子尤其是蛋白質、多肽分子量和一級結構的有效工具。

(二)核磁共振

由于信號的純數(shù)字化、重疊范圍過寬(由于相對分子質量太大)和信號弱等，核磁共振( nuclear magnetic resonance，NMR)圖譜在多肽的分析中應用較少，隨著二維、三維以及維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發(fā)展，NMR才逐漸成為多肽分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列及定量混合物中的各組分含量等，但應用于多分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的多肽有特定的形狀面便于定量與定性分析，如何縮短數(shù)據(jù)處理的時間等，這些問題均有不少學者在進行研究，NMR在分析含少于30個氨基酸的多肽時比較有效

最近的超高場超導磁鐵的建造已將NMR研究的分子質量范圍擴展到100kD以上如此大的蛋白質分子，其NMR譜常遇到譜帶增寬的問題， Wuthrich等研究的橫向池豫優(yōu)化光譜法( transversal relaxation optimized spectroscop， TRDSY為此提供了解決方法

(三)紅外光譜

紅外光譜是鑒定有機化合物結構的重要方法，具有樣品用量小和不需要高純晶體等特點。用紅外光譜法研究多肽等的結構、構象，能反映與正常生理條件(水溶液、溫度、酸堿性等）相似情況下的生物大分子的結構變化信息，這是用其它方法難以做到的。

用傅里葉變換紅外光譜方法研究蛋白質和多肽二級結構，主要是對紅外光譜中的酰胺I譜帶(氘代后，稱酰胺I譜帶)進行分析，酰胺I譜帶為α螺旋，β折疊、無規(guī)則卷曲和轉角等不同結構振動峰的加合帶，彼此重疊，在1620~42500px-1范圍內通常為一個不易分辨的寬譜帶。目前常應用去卷積微分等數(shù)學方法，對加合帶中處于不同波數(shù)的各個吸收峰進行分辨，最后經(jīng)譜帶擬合，獲得各個吸收峰的定量信息。

紅外光譜可用于監(jiān)測酰胺質子的交換速率，暴露于表面的質子比處于中心的質子H/D交換要快得多。內部伸縮區(qū)或參與二級結構形成的酰胺質子交換速率為中等。它可以提供多肽或蛋白質的所有氨基酸殘基的信息。

(四)紫外光譜

在研究生物大分子的溶液構象時，紫外可見吸收光譜是十分重要的方法。它對測定樣品沒有特殊要求，只需處于溶液狀態(tài)即可，因此紫外光譜在探索生物大分子結構與功能的關系方面可獲得有意義的信息。蛋白質在紫外光范圍內(250~300mm)的光吸收主要是由于芳香族氨基酸Trp及Tyr，其次是Phe和His的電子激發(fā)引起的。

(五)圓二色譜

多肽多為手性分子，實驗室主要采用圓二色譜( circular Dichroism spectra，CD)研究分子的立體結構、反應動力學及在溶液中的構象變化等。CD譜具有UV分析相同的精密度但比UV的靈敏度高，而且在UV譜中的重疊的峰在CD譜中也有可能分開。CD的測定通常是分子橢圓度[θ]的測定，它表示該物質由于分子的光學不對稱性而對左、右圓偏振光有不同程度的吸收。根據(jù) Cotton效應，[θ值只在吸收峰有較大的值，并且與吸收峰波長位置相對應，而多肽的紫外吸收光譜主要有兩個吸收峰，在280m處的吸收峰由芳香族側鏈引起(主要是Tyr、Tp、Phe)，但在波長約低于230mm時，不但有其他氨基酸側鏈的電子躍遷，還有肽鏈骨架本身電子位移的躍遷所引起的吸收，因而通過對這一區(qū)域的CD研究可以分析多肽主鏈的構象。

(六)X射線晶體學

X射線晶體學方法是迄今為止研究蛋白質結構最有效的方法，所能達到的精度是任何其他方法所不能比擬的。其缺點是蛋白質/多肽的晶體難以培養(yǎng)，晶體結構測定的周期較長。X射線衍射技術能夠精確測定原子在晶體中的空間位置；中子衍射和電子衍射技術則用于彌補X射線衍射技術的不足。生物大分子單晶體的中子衍射技術用于測定生物大分子中氫原子的位置；纖維狀生物大分子的X射線衍射技術用于測定這類大分子的一些周期性結構，如螺旋結構等；電子顯微鏡技術能夠測定生物大分子的大小、形狀及亞基排列的二維圖像；它與光學衍射和濾波技術結合而成的三維重構技術能夠直接顯示生物大分子低分辨率的三維結構。

除上述方法之外，場解析質譜、生物鑒定法、放射性同位素標記法及兔疫學方法等都已應用于多肽類物質的結構鑒定、分析檢測之中。

可轉載，不可復制商用。文章部分內容源自《多肽藥物研究與開發(fā)》。