“克隆”顧名思義，即體細胞無性繁殖，1個細胞分裂成2個細胞，進行種群繁殖并擴大的過程，通過克隆形成率可以反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀，是體外測定細胞增殖能力的一種常用技術。這項實驗雖然操作簡單，卻有很多同學在最終拍照時很難拿到好看的圖片，不得不一次又一次重復實驗，今天我們就看看如何規(guī)范的做克隆形成實驗。

克隆形成的目的

1. 評價不同殺傷因素（藥物、基因等）對腫瘤細胞增殖能力或群體依賴性的敏感性；

2. 評價細胞在體內(nèi)成瘤性，癌細胞不一定都可以在體內(nèi)成瘤，但若體外克隆能力越強，即表明體內(nèi)成瘤性越強，算是一種模擬體內(nèi)成瘤的體外實驗。

克隆形成實驗步驟

a.接種：取對數(shù)期生長的細胞以500-1000個/孔的密度接種于6孔板（接種時注意梯度稀釋細胞懸液，觀察細胞密度，以免因計數(shù)不準確導致實驗結果偏差），每個實驗組設3個復孔，培養(yǎng)基為含30%FBS的完全培養(yǎng)基；

b.于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-14天左右，每隔3天進行換液并觀察細胞狀態(tài)，顯微鏡下觀察克隆大?。?/span>3復孔之間克隆大小應相似），待單個克隆生長到大小不超過圖片視野時可以進行拍照（如下圖左）

c.固定染色：移除培養(yǎng)基，PBS洗滌細胞，4%多聚甲醛固定細胞20 min；移除多聚甲醛，用0.2%結晶紫染色5min；用水洗滌細胞，晾干，掃描拍照；（如下圖右）

d.計數(shù)

注意！注意！注意！高能預警

細胞密度為多少合適？

細胞接種密度與最終實驗結果密切相關，若細胞太多，形成克隆數(shù)目太多，很難拍到單獨的克隆團。而細胞太少，可能無法形成克隆，從而影響對該細胞增殖能力的判斷。一般來說，正常增殖速度為1:5-1:10傳代，3天長滿細胞，可以接種500個細胞，其余增殖緩慢細胞，可以接種800-1000。

細胞接種后培養(yǎng)的時間，如何確定？

通常情況下，單個細胞在體外增殖6代以上所組成的細胞群稱為一個陽性克隆，時間約為一周；但具體時間因細胞增殖能力而已異，因此應密切關注細胞生長情況，隔天在顯微鏡下觀察克隆情況，若單個克隆細胞數(shù)到達50個左右即可固定細胞。

細胞鋪板均勻的重要性

若鋪板不均勻，細胞稀的地方形成的克隆少，而密的地方克隆多，一方面影響統(tǒng)計結果，并且拍出的圖片不美觀。

細胞未形成克隆的原因？

并非每種細胞都可以形成克隆，克隆形成率與細胞本身增殖能力有關。還與接種細胞密度，加入培養(yǎng)液的體積、血清濃度有關。因該實驗處理時間較長，應給細胞多加培養(yǎng)基，如每孔4ml，或者3天更換一次培養(yǎng)基，以供給細胞充足的營養(yǎng)。

以上為本次為大家介紹的細胞克隆形成的實驗方法，它們的操作過程很簡單，但是我們會遇到很多小問題，導致最終結果不理想，切記，控制接種密度，鋪板均勻是2大關鍵點，多多練習摸索，一定會有好數(shù)據(jù)和圖片哦！