Integrative analysis of genomic and epigenomic regulation of the transcriptome in liver cancer

文章關(guān)鍵詞：肝癌，DNA甲基化，組蛋白修飾，轉(zhuǎn)錄組

近年來聯(lián)合多組學(xué)分析已經(jīng)成為表觀領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，利用單一組學(xué)數(shù)據(jù)分析致病因子的局限性愈發(fā)顯著。通過對(duì)多種層次和來源的高通量組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析，系統(tǒng)地研究臨床發(fā)病機(jī)理、確定最佳疾病靶點(diǎn)已經(jīng)成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究的重要發(fā)展方向。

多組學(xué)聯(lián)合分析將有助于人們更加系統(tǒng)全面的認(rèn)識(shí)腫瘤的生物學(xué)行為，進(jìn)一步為尋找有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物和探討腫瘤相關(guān)機(jī)制提供新的線索。今年來多組學(xué)在肺癌，胃癌等癌癥的研究當(dāng)中取得了不錯(cuò)的研究進(jìn)展隨著組學(xué)分析技術(shù)的不斷發(fā)展，整合基因組，表觀組，轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)分析，可以多層級(jí)全面的了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。。這篇NC文章聚焦在了肝癌這個(gè)腫瘤上面，看看組學(xué)分析能夠得到什么有意思的發(fā)現(xiàn)呢？

簡(jiǎn)單介紹一下今天的主角：HCC，肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma HCC）是常見的惡性腫瘤類型之一，在全球癌癥死亡原因中排名第二，大約90%的原發(fā)肝癌都屬于肝細(xì)胞癌。中國是HCC患病率最高的地區(qū)，每年約50%以上的新診斷和死亡的病例都發(fā)生在中國,并且我國被診斷為肝癌的患者平均年齡為55-59歲，比國外肝癌低發(fā)率國家要早近20年[1,2,3]。肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC），全球惡性癌癥死因“惡名榜”第二。中國是HCC的重災(zāi)區(qū)，不僅“貢獻(xiàn)”50%的全球HCC新發(fā)和死亡病例，且平均年齡55-59歲比國外HCC低發(fā)國家早近20年。

一：Summary

?  作者從以轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)入手，結(jié)合基因組數(shù)據(jù)和表觀數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析。看能不能找到與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的異?；蚧蛘呤峭贰?/ins>

?這篇文章主要關(guān)注)肝癌轉(zhuǎn)錄組學(xué)基因和表觀遺傳的差異[1] [2] 

主要研究思路是：1.分析64個(gè)肝癌病人樣本中，DNA甲基化（METcor）和DNA拷貝數(shù)變異（CNVcor），探究?jī)烧?/ins>是否在肝癌發(fā)病上存在“共調(diào)控”作用（這里增加用到的技術(shù)手段，如富集分析、熱圖分析，下面亦然，讀者一開始看到這里會(huì)介紹不同工具的實(shí)際應(yīng)用才有繼續(xù)讀下去的欲望，反正我是這個(gè)樣子的）

2.進(jìn)一步研究，能否根據(jù) MET cor和CNV cor進(jìn)行肝癌分型，在TCGA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行驗(yàn)證（NMF算法）

3.篩選對(duì)HCC侵襲性影響最大的基因變異BAP1，用Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證.
In this paper abstract, the author gives these results:
??1: The frequencies of the aberrancies of the DNA copy-number-correlated (CNV cor)expression genes and the methylation-correlated expression(METcor) genes are co-regulated significantly.
??(異常的MET和CNV的基因有些顯著的共調(diào)控作用)

??2:Multi-omics integration of the CNVcor and METcor genes reveal three prognostic subtypes of hepatocellular cacinoma. which can be validated by an independent data.
??（多組學(xué)整合分析異常的CNV/DNA甲基化相關(guān)基因揭示了肝癌的三個(gè)亞型，并且得到了獨(dú)立數(shù)據(jù)的驗(yàn)證）

帶著問題去思考：
1：Why they choose HCC?
為什么選擇肝癌？
2：How to find the high correlation between CNVcor and DNAcor?
作者是找到這些異常的DNA甲基化基因和拷貝數(shù)變異的基因的？
3：How to prove this correlation mechanism?
如何去如何起證明這些基因的共調(diào)控作用呢？既然共調(diào)控，調(diào)控機(jī)制是什么？（或者是說如何去聯(lián)系DNA甲基化和拷貝數(shù)變異的？）
4：How to classify the carcinoma subtype? and how to show the result?
對(duì)肝癌進(jìn)行分型是如何分的？分類結(jié)果如何顯示呢？怎么驗(yàn)證我的結(jié)果（畢竟自己的樣本量很?。?/ins>
5：How to find the most significant gene which has the pivotal role in tumor aggression?
如何篩選功能最顯著表達(dá)差異的基因（如何篩選到BAP1?）既然我根據(jù)變異進(jìn)行了分型，那么在這當(dāng)中貢獻(xiàn)最大是哪個(gè)基因，怎么篩選

二：Introduction

1:DNA methylation and CNV aberrationor mutation occur in cancer progression.
(DNA甲基化和拷貝數(shù)變異發(fā)生在腫瘤的侵襲中)

2：As HCC, genomic profiling studies demonstrated the enormous heterogeneity of genomic and epigenomicderegulation.
(肝癌是重大公共衛(wèi)生問題，中國尤甚；同時(shí)對(duì)于肝癌來說，基因組和表觀組的異質(zhì)性大)

3：In previous study, several key cancer-related gene such as IGF2 UHRF1 regulation function by DNA methylation
(在之前的研究中，一些癌癥相關(guān)的基因通過DNA甲基化去發(fā)揮功能作用，如 IGF2 UHRF1這些基因)

4：The transcription has influenced by the CNV and DNA methylation , whether it has co-correlation is unclear .
(轉(zhuǎn)錄受到DNA甲基化和拷貝數(shù)變異的影響，既然都可以影響轉(zhuǎn)錄，那么他們之間有沒有協(xié)同作用呢？這方面的研究還不是很清楚)

5：Genomic and epigenomic profiles of DNA copy-number variation (CNV), DNA methylation (MET), and gene expression (EXP) were obtained from 64 HCC patients
(一共用了64個(gè)肝癌的CNV,MET,EXP樣本信息)[3] [4] 

三：Result

3.1 Transcriptome deregulation by DNA copy number or methylation

(DNA甲基化和拷貝數(shù)變異會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失調(diào))

a. 分別計(jì)算DNA甲基化MET[5] 和mRNA表達(dá)的相關(guān)性（藍(lán)色的），CNV和mRNA表達(dá)的相關(guān)系（紅色的），然后發(fā)現(xiàn)DNA甲基化（MET）是和表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的，而CNV和表達(dá)呈正相關(guān)（因?yàn)?span style="text-decoration:line-through;">DNA甲基化MET相關(guān)性系數(shù)分布偏左邊為-0.153，反之~）

b.在a圖的基礎(chǔ)上，需要找到差異顯著的那些基因，然后|r|>0.5，也就是紅圈圈的位置，然后發(fā)現(xiàn)了CNVcor有813個(gè)，METcor有321個(gè)。把這幾個(gè)基因集進(jìn)行求交集發(fā)現(xiàn)了只有24個(gè)overlap基因.

ps:拿到這些基因做了一個(gè)富集分析，發(fā)現(xiàn)CNV差異基因富集在蛋白相關(guān)的信號(hào)通路上，MET的差異主要富集在炎癥反應(yīng)等上面（感覺富集到的結(jié)果可能做不出什么文章。然后繼續(xù)往下看）

c. CNV基因顯示出了它的一個(gè)基因組偏好性，比較集中在8號(hào)染色體上。DNA甲基化的基因在全基因組上分布沒有偏好性。

d.（左圖） 發(fā)現(xiàn)DNA甲基化的基因一般都分布在inter-genic(基因間區(qū))而不是CpG島。（右圖）發(fā)現(xiàn)DNA甲基化更偏向于發(fā)生在基因body區(qū)域，推測(cè)開放區(qū)域的甲基化可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄異常，芯片中CpG島的表達(dá)方式N_shore,N_shelf等。[6] [7] 

e:因?yàn)橐呀?jīng)拿到了60多個(gè)病人樣本，計(jì)算每個(gè)病人樣本的CNVcor上調(diào)和下調(diào)的基因個(gè)數(shù)，METcor上調(diào)和下調(diào)的個(gè)數(shù)。然后畫出e的柱狀圖。（不同顏色代表上下調(diào)的基因）下面那個(gè)熱圖的意思就是說紅色的上調(diào)的，藍(lán)色的是下調(diào)的基因位點(diǎn)。

f:去尋找CNVcor上調(diào)和下調(diào)基因和METcor上調(diào)和下調(diào)的相關(guān)性。每個(gè)點(diǎn)代表著一個(gè)病人樣本。橫縱坐標(biāo)代表這個(gè)病人的差異基因的個(gè)數(shù)，然后做了一個(gè)相關(guān)性分析。（但是這個(gè)相關(guān)性系數(shù)值不大，最大的0.86，CNV_DOWN和MET_DOWN有正相關(guān)，其他的都是弱相關(guān)了)

Q:這整個(gè)一個(gè)大Figure說明了什么？

A:個(gè)人認(rèn)為是確定DNA甲基化和拷貝數(shù)變異適合轉(zhuǎn)錄組異常相關(guān)的，至于有多么相關(guān)，數(shù)據(jù)給出信息。

3.2 Molecular subtype based on CNVcor and METcor genes

對(duì)于CNV和MET差異表達(dá)基因可以用于肝癌的分子分型

a，b:非負(fù)矩陣分解(Non-negative Matrix Factorization，NMF)算法【這是無監(jiān)督學(xué)習(xí)算法的一種，和k-mean，分層聚類等目的一樣，為了把這些樣本進(jìn)行分類。感興趣的可以看看：https://blog.csdn.net/google19890102/article/details/51190313】對(duì)CNV和MET基因進(jìn)聚類，然后得到的結(jié)果，OS 是overall survival（總體生存時(shí)間），TTR是time to tumor recurrence（腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間）。發(fā)現(xiàn)對(duì)于CNV分類來說可以把這些樣本分成3類，用MET分類的話可以分成4類。而且從分類效果OS,TTR來看CNV的分類效果更好。

[iCluster,：一種可以利用R包進(jìn)行分類的分類方法，詳情可以見：http://www./packages/devel/bioc/html/iClusterPlus.html]
c:熱圖顯示了iCluster分析鑒定的亞型表達(dá)模式。使用NMF聚類方法鑒定的CNVcor或METcor基因的亞型的比較，每個(gè)亞型鑒定的結(jié)果用彩色條形標(biāo)記。每個(gè)亞型中CNVcor-up、CNVcor-down、METcor-up、METcor-down基因的異常表達(dá)頻率如圖(最底下)所示。中間的是熱圖。

d:用K-Mean的方法畫出利用icluster方法分類的這種類型的OS,TTR曲線，看看分類效果。

【我們還比較了iCl1，iCl2和iCl3亞組的臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)iCl1腫瘤比iCl2或iCl3的侵襲性更強(qiáng)（P = 0.002，表1）。 其他臨床特征在亞組之間沒有差異。 這些結(jié)果與分子亞型的獨(dú)特侵襲性特征一致。 基于這些發(fā)現(xiàn)，我們建議CNVcor和METcor基因的綜合分析可以識(shí)別分子亞型，每個(gè)分子亞型具有與轉(zhuǎn)錄失調(diào)相關(guān)的基因組和表觀基因組特征的不同組合，與不同的預(yù)后結(jié)果相關(guān)。】

Q：得到了這個(gè)分類結(jié)果，相當(dāng)于一個(gè)訓(xùn)練集，那么如何驗(yàn)證這個(gè)訓(xùn)練集的分類效果呢？
A：利用數(shù)據(jù)庫，大樣本庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證

3.3 Validation of the molecular subtypes in an TCGA data set

這個(gè)目的就是為了在大樣本庫中重復(fù)他們之前結(jié)果，用的數(shù)據(jù)是TCGA的數(shù)據(jù)
a:觀察到CNV和轉(zhuǎn)錄組之間的相關(guān)系數(shù)的總體分布向右偏，MET左偏，

b,c:尋找差異的基因，求交集，發(fā)現(xiàn)CNVcor基因在8號(hào)染色體進(jìn)行富集和之前一致

d.e: METcor基因在open sea區(qū)域和gene body域比在CpG島和TSS區(qū)域富集更頻繁 此外，異常CNVcor和METcor基因的頻率之間的相關(guān)性也得到驗(yàn)證，相關(guān)性0.82.

f,g :分類效果，C1組DNA拷貝數(shù)和DNA甲基化畸變率最高，C3組最低

h：OS,RFS分析圖

Q:發(fā)現(xiàn)利用CNV和DNA甲基化是可以用作分子分型的，大樣本也重復(fù)出來了結(jié)果，接下來如何分析呢？如何去找DNA甲基化和拷貝數(shù)變異的關(guān)系呢？

我們接下來看看作者如何借助統(tǒng)計(jì)學(xué)去試圖尋找答案

3.4 Coordinated aberrations of DNA copy numbers and methylation

整合DNA甲基化數(shù)據(jù)和拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)

圖a,b整合了TCGA的數(shù)據(jù)和他們自己已有的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
CNVgain的頻率與CNVloss的頻率顯著正相關(guān)（r = 0.43，P = 1.5×10-20，圖4a）。 相反，MET gain的頻率與MET loss的頻率呈負(fù)相關(guān)。

在C圖中，我們可以看到橫坐標(biāo)是CNV頻率，縱坐標(biāo)是MET頻率，可以看出他們有顯著的相關(guān)性

在圖d,e,f,g中，分別以CNV gain ,CNV lose，MET gain ,MET loss進(jìn)行坐標(biāo)變換。然后都發(fā)現(xiàn)他們的之間的相關(guān)性與橫縱坐標(biāo)軸的變量變化無關(guān)。

（雖然不太明白它這么比的目的是啥）
[8]    總之，我們認(rèn)為頻繁的DNA拷貝數(shù)異常的HCC患者更可能經(jīng)常出現(xiàn)DNA甲基化異常。 異常CNVcor和METcor基因的這些相關(guān)頻率可能意味著DNA拷貝數(shù)和DNA甲基化的異常之間的密切關(guān)系。[9] [10] 

3.5 Identification of genomic key features in the HCC subtypes

a:TCGA中肝癌的數(shù)據(jù)樣本分析，剔除了同義突變后，篩選出在189個(gè)發(fā)生10次以上突變的重復(fù)突變基因，我們鑒定出37個(gè)差異突變基因，其中>5 %的突變頻率在C1、C2、C3亞型之間存在差異（其中有2個(gè)肝癌樣本沒有基因組突變數(shù)據(jù)），發(fā)現(xiàn)了BAP1是C1突變的最頻繁的基因。CTNB1是C2,C3當(dāng)中突變最頻繁的基因，而且和腫瘤的發(fā)展高度相關(guān)。

b:GeneMania軟件做的圖（基因間相互作用的，可以在cytocsape里面裝這個(gè)插件，也可以去分析網(wǎng)站GeneMANIA，網(wǎng)址： http://），為了找到亞型的功能決定區(qū)域，利用SNU和TCGA數(shù)據(jù)交集CNVcor genes (n?=?95) and METcor genes (n?=?179)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了UBC 這個(gè)基因在CNV基因集中相關(guān)系數(shù)很高。（越靠中心說明了越重要。）

c:先對(duì)這兩個(gè)基因集求一下交集，找到相同的差異的上調(diào)或者下調(diào)的基因。舉個(gè)例子來說：CA9是iCl1/C1腫瘤中上調(diào)表達(dá)差異最大的基因。（在文獻(xiàn)中，CA9是缺氧的一個(gè)標(biāo)志物，其過表達(dá)在HCC19中是一個(gè)不好的預(yù)后標(biāo)志物。此外，與其他亞型相比，侵襲性iCl1和C1腫瘤表達(dá)了高水平的干細(xì)胞相關(guān)基因，如KRT19、EPCAM和PROM1。與Rhee, H等人.報(bào)道的CA9的表達(dá)與HCC中干細(xì)胞相關(guān)表型相關(guān)[11] [12] 的結(jié)果符合[4]。）

??基于這個(gè)可能和干性[13] 有關(guān)的特性，進(jìn)一步評(píng)估已知的和干性相關(guān)的基因集(即， ESC、Nanog、Oct4、Sox2、Myc1、Myc2等已知的和細(xì)胞干性相關(guān)的基因集)。在熱圖中，黃色代表高表達(dá)，藍(lán)色代表低表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在IC1,C1中這些干性的基因集高表達(dá)了。說明和這些差異表達(dá)的基因和腫瘤干性有關(guān)系。
??我們還將我們的分類與之前定義HCC亞型分子分型分類器的研究進(jìn)行了比較。Kim_65 genes (34 out of 65), Yamashita_EpCam_DOWN (7 out of 18), Woo_CLHCC_DOWN (203 out of 374), and Boyault_G123_DOWN (26 out of 50) 展現(xiàn)出來和篩選出來差異基因有overlap。這也意味著這些以前的分類器的表達(dá)可能與CNVcor和METcor基因畸變的頻率有關(guān)。

（PS:腫瘤干細(xì)胞(CsC)理論認(rèn)為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)與CsC密切相關(guān),對(duì)CSC的研究已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。自我不斷的更新復(fù)制以及保持分化的潛能是干細(xì)胞的特性。Sox2、Nanog等轉(zhuǎn)錄因子是維持干細(xì)胞干性的核心轉(zhuǎn)錄因子，那么有關(guān)于這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況是作者探究肝癌細(xì)胞是否具有干性的核心關(guān)注點(diǎn)。）

??綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)提示，與DNA拷貝數(shù)和DNA甲基化相關(guān)的HCC分子亞型也與BAP1和CTNNB1突變有關(guān)，這可能在HCC亞型進(jìn)展中發(fā)揮調(diào)控作用。對(duì)于分類結(jié)果來說，我們認(rèn)為C1和iCl1腫瘤可能具有這些亞型的共同功能特征，如侵襲性或干性。我想知道為什么這里分析出兩個(gè)突變，后面只驗(yàn)證了一個(gè)：因?yàn)镃1是惡性程度最高的HCC，所以更關(guān)注BAP1，另外一個(gè)就不詳細(xì)研究

d:展示了BAP1抑制對(duì)肝癌細(xì)胞干細(xì)胞基因表達(dá)的影響。Huh7細(xì)胞通過轉(zhuǎn)染以BAP1 shrna，下調(diào)BAP1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了包括CA9、KRT19、EPCAM、PROM1在內(nèi)的stemness基因的顯著上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果有力地支持了我們的發(fā)現(xiàn)，即BAP1突變可能至少在一定程度上促進(jìn)了一種侵襲性HCC亞型表達(dá)。

這篇文獻(xiàn)的主圖基本上就講到這里了。看完之后思考之前的問題：

回到之前的問題：
1：Why they choose HCC?
為什么選擇肝癌？
因?yàn)楦伟┰谌虻陌l(fā)病率死亡率非?？壳?ins datetime="2019-03-04T11:04">，而且CNV和MET異質(zhì)性比較大。研究既有實(shí)際意義又有可行性
2：How to find the varient and high correlation CNVcor and DNAcor?
作者是找到這些異常的DNA甲基化基因和拷貝數(shù)變異的基因的？
通過表達(dá)譜，找到|r|>0.5的那些位點(diǎn)，進(jìn)行分析。同時(shí)通過TCGA的樣本分析，也找到很多這種差異表達(dá)基因。
3：How to prove this correlation mechanism?
如何去如何起證明這些基因的共調(diào)控作用呢？既然共調(diào)控，調(diào)控機(jī)制是什么？（或者是說如何去聯(lián)系DNA甲基化和拷貝數(shù)變異的？）
通過尋找相關(guān)性,畫線形圖，找到相關(guān)性系數(shù)最大的進(jìn)行比較。總體來說，通過自己的64個(gè)肺癌樣本+TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證，證明了CNVcor和METcor基因的頻率之間的相關(guān)性。
4：How to classcify the carcinoma subtype? and how to show the result?
對(duì)肝癌進(jìn)行分型是如何分的？分類結(jié)果如何顯示呢？
利用了非負(fù)矩陣分解，對(duì)CNVcor和METcor的基因進(jìn)行分類得到結(jié)果C1,C2,C3。并且比較了這幾類的總體生存率和轉(zhuǎn)移率。
5：How to find the most significant gene which has the pivotal role in tumor aggression?
如何篩選功能最顯著表達(dá)差異的基因（如何篩選到BAP1?）
通過找到基因的突變頻率，然后發(fā)現(xiàn)了BAP1這個(gè)基因在C1里面突變的頻率是最多的，然后CTNB1在C3里面突變頻率更高。（ps:通過求兩個(gè)基因集的overlap進(jìn)行熱圖分析，可以發(fā)現(xiàn)一些和干性相關(guān)的基因，并且進(jìn)了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證）

文獻(xiàn)thinking:
1：首先樣本的數(shù)量60多對(duì)，感覺不是很多。而且作者在文章中也承認(rèn)樣本量的問題會(huì)造成結(jié)果的偏差。（雖然TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證可以部分找補(bǔ)）
2：對(duì)于采取聚類的方式，用icluster這個(gè)是當(dāng)reference嗎？目的沒太明白
3：還有一些點(diǎn)可以深挖掘，比如說找到了一下表達(dá)差異相關(guān)的基因，那么這些基因在表觀上有沒有其他的作用，（雖然有討論Bap1和H3K27me3的關(guān)系）比如說是不是還有其他和組蛋白修飾或者是ncRNA有關(guān)？
4：找到的這些significant基因當(dāng)診斷的marker是否可行（或者治療靶點(diǎn)）？
5：DNA甲基化和CNV的相關(guān)性問題，既然找到了CNV_DOWN和MET_DOWN有正相關(guān)，圖一f中，是不是可以繼續(xù)挖下去呢？進(jìn)一步解釋一下DNA甲基化和CNV之間的是如何影響的呢？畢竟文章只是說存在相關(guān)性。

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