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在科研界的江湖中，流傳著兩大神器——Graphad和 ImageJ，堪稱(chēng)數(shù)據(jù)圖像分析處理的“倚天劍”和“屠龍刀”。確實(shí)，它倆一經(jīng)問(wèn)世，就翻著花樣包裝處理著實(shí)驗(yàn)結(jié)果（原數(shù)據(jù)及圖片），使其從屌絲瞬間逆襲為高富帥，這才能榮登高大上的期刊雜志?，F(xiàn)如今，已鮮有軟件能奪其鋒芒了。

尤其就ImageJ（官網(wǎng)：https://imagej./ij/ , 不受電腦系統(tǒng)限制）這個(gè)圖像分析大殺器，WB灰度定量、細(xì)胞計(jì)數(shù)等完全不在話(huà)下，傻瓜式操作可簡(jiǎn)單粗暴對(duì)圖像進(jìn)行抽絲剝繭般的分析，讓實(shí)驗(yàn)結(jié)果所暗藏的規(guī)律清晰明了地呈現(xiàn)你的面前。

然而，這還僅僅只是ImageJ小試牛刀，不少潛能還隱藏在深海之下。最近，ImageJ再次按捺不住一腔熱血，劍芒所指，誓要把細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞共定位收入囊下。各位科研志士們，還不速速習(xí)來(lái)，為自己苦心撰寫(xiě)論文再添一抹亮色。

再說(shuō)這細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（Wound Healing），它在細(xì)胞遷移/腫瘤侵襲方面確是一把好手。

在人為的給鋪板的單層細(xì)胞劃開(kāi)一個(gè)空白無(wú)細(xì)胞地帶后，劃痕邊緣的細(xì)胞便會(huì)努力遷移并逐漸覆蓋空白區(qū)域來(lái)使劃痕愈合，在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移過(guò)程。

因而只需統(tǒng)計(jì)劃痕面積（Scratch Area）隨著時(shí)間的變化率以及傷口愈合百分比（Wound healing percentage），即可對(duì)細(xì)胞的侵襲性了如指掌。

A549劃痕實(shí)驗(yàn)

ImageJ分析細(xì)胞劃痕面積

那么如何在ImageJ中實(shí)現(xiàn)上圖劃痕面積和傷口愈合百分比的分析呢？且小編娓娓道來(lái)。

打開(kāi)ImageJ軟件，其界面如下：

File，Open，選擇待分析圖片（A549），界面如下：

增強(qiáng)對(duì)比：Process，Enhance Contrast，出現(xiàn)如界面：

勾上Normalize，Saturated pixels：0.3%，點(diǎn)擊OK，效果如下：

Process，Smooth（平滑），效果如下：

Process，F(xiàn)ind Edges（尋找邊緣），效果如下：

Image，Adjust，Threshold，閾值選定，選中為紅色，調(diào)節(jié)閾值為0—20。點(diǎn)擊Apply。

效果如下：

選擇魔棒工具，魔棒工具位于下圖右下角：

點(diǎn)擊黑色的劃痕部分，效果如下：

點(diǎn)擊Analyze，Measure，結(jié)果如下，劃痕面積Area為43328平方像素。根據(jù)最開(kāi)始的劃痕面積，跟某一時(shí)間愈合的那一部分面積（最開(kāi)始面積-某時(shí)間點(diǎn)的面積）與最初面積的比值即可得到傷口愈合的百分比。

由此我們得到了劃痕面積（Scratch Area）隨著時(shí)間的變化、傷口愈合百分比（Wound healing percentage），進(jìn)行后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析即可。

將劃痕面積輪廓添加到原圖片（見(jiàn)下圖），如何實(shí)現(xiàn)？

Analyze，Tools，ROI Manager，出現(xiàn)以下界面：

將魔棒選中的ROI添加添加進(jìn)ROI Manager，點(diǎn)擊Add，選擇右下方的Show All和Labels。

重新打開(kāi)A549圖片原圖，點(diǎn)擊Image，Overlay，F(xiàn)rom ROI Manager，得到如下界面：

PS：關(guān)于面積單位，如果不進(jìn)行標(biāo)尺校正，得到的長(zhǎng)度單位為pixel像素，面積單位為平方像素pixel2。

上圖的左上角可以看見(jiàn)圖片的大小為347x236 pixels，即A549圖片未進(jìn)行標(biāo)尺校正。如何進(jìn)行標(biāo)尺校正：

打開(kāi)一張帶有標(biāo)尺的圖片，如下圖（標(biāo)尺見(jiàn)右下角）：

選擇直線(xiàn)工具：

沿著標(biāo)尺畫(huà)一條直線(xiàn)，如下圖：

點(diǎn)擊Analyze，Set Scale

點(diǎn)擊Click to Remove Scale，在Known distance下填入已知的長(zhǎng)度50μm，Unit of length填入對(duì)應(yīng)單位，選擇Global為對(duì)之后打開(kāi)的圖片都有效，否則只對(duì)當(dāng)前圖片有效。

點(diǎn)擊OK

此時(shí)圖片左上角的圖片大小長(zhǎng)和寬變?yōu)榱宋⒚?，如下圖：

若此時(shí)再進(jìn)行面積或長(zhǎng)度的計(jì)算，單位就是已經(jīng)校準(zhǔn)的單位了。

細(xì)胞共定位

File , Open打開(kāi)想要分析的兩張熒光圖片。如下圖

將兩幅圖片變成圖像棧，image， stacks ， images to stack，彈出以下界面：

點(diǎn)擊OK,即可通過(guò)滾動(dòng)條在同一個(gè)圖像棧查看兩幅圖片。

選擇直線(xiàn)工具：，在圖像棧中的一幅圖片中的目標(biāo)區(qū)域畫(huà)一條直線(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)兩幅圖都會(huì)出現(xiàn)相同的直線(xiàn)。

Analyze菜單下，點(diǎn)擊Plot Profile，可彈出一個(gè)關(guān)于以線(xiàn)起點(diǎn)到終點(diǎn)為距離的X軸以及相應(yīng)的灰度值的窗口。圖像棧中每一幅圖片都有對(duì)應(yīng)結(jié)果，當(dāng)滾動(dòng)滾動(dòng)條轉(zhuǎn)換不同圖片的時(shí)候，點(diǎn)擊“l(fā)ive”，結(jié)果就會(huì)彈出來(lái)。

圖像棧中每幅圖對(duì)應(yīng)的距離與灰度值二維的結(jié)果圖

點(diǎn)擊“l(fā)ist”按鈕，可以彈出具體X、Y數(shù)值的結(jié)果窗口，也可以點(diǎn)擊“Save”按鈕，保存以excel文件的數(shù)據(jù)。

分別點(diǎn)擊“l(fā)ist”，得到相應(yīng)的X， Y軸數(shù)據(jù)

點(diǎn)擊Save保存excel數(shù)據(jù)

可以利用excel作圖，使圖形更加美觀（這里沒(méi)有具體調(diào)節(jié)圖形，只調(diào)節(jié)個(gè)別細(xì)節(jié)，excel作圖不再贅述，見(jiàn)下圖）。圖中，我們可以看出代表red，blue兩種染料有共定位的現(xiàn)象。

excel對(duì)結(jié)果的作圖