氧化磷酸化 ( OXPHOS ) 在細(xì)胞的能量代謝中起著核心作用。OXPHOS由核基因組和線粒體基因組編碼的90多種蛋白質(zhì)組成。OXPHOS電子傳遞鏈由四種復(fù)合物(I到IV)組成，它們將TCA循環(huán)和脂肪酸氧化生成的電子從供體轉(zhuǎn)移到氧。復(fù)合物I至IV將質(zhì)子泵入線粒體膜間隙，增加線粒體膜內(nèi)pH值，形成電壓梯度。復(fù)合物V  ( F0F1 ATP合酶 ) 利用質(zhì)子梯度中儲(chǔ)存的能量產(chǎn)生ATP?；钚匝跏请娮觽鬟f鏈和ATP合成過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，通過線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔 ( mPTP ) 等多種機(jī)制可以減輕其毒副作用。

近日，美國Memorial Sloan Kettering腫瘤中心的研究人員最近在《Nature》上報(bào)道了靶向氧化磷酸化來殺傷膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的首個(gè)全新小分子Gboxin，并可以有效致死膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞。

大部分基于細(xì)胞的“抗癌”藥物篩選研究主要是干擾有絲分裂、DNA復(fù)制或損傷修復(fù)。為了區(qū)分癌細(xì)胞和正常分裂的細(xì)胞，研究人員構(gòu)建了基于原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的高通量篩選體系。他們首先建立了一個(gè)自發(fā)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤小鼠模型，在GFAP-cre轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的重組下，三個(gè)GBM相關(guān)腫瘤抑制因子 ( Trp53、Pten和Nf1 ) 發(fā)生突變導(dǎo)致小鼠自發(fā)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；然后將多個(gè)GBM腫瘤低傳代球狀培養(yǎng)物混勻成細(xì)胞池，建立原發(fā)性高通量GBM球狀細(xì)胞系 ( High-throughput GBM sphere, HTS ) 用于高通量篩選，利用96-h Cell-Titer-Glo的方法在上述細(xì)胞上篩選了200,000個(gè)化合物。

為了排除非特異性或抗有絲分裂的毒性，他們還對(duì)初級(jí)低傳代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 ( MEFs ) 、新生星形膠質(zhì)細(xì)胞和初級(jí)腦室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞進(jìn)行了差異性篩選，最終篩選出61個(gè)IC50在nM級(jí)別的化合物。S9 fraction和hepatocyte assays進(jìn)一步復(fù)篩這61個(gè)化合物，得到了17個(gè)潛在藥物代謝較好的化合物，并依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可改造性選定了最終的3個(gè)化合物，其中包括Gboxin。Gboxin ( IC50 = 150 nM ) 及其衍生物均可以特異性抑制HTS細(xì)胞的生長，且不抑制初生MEFs或星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長。

Gboxin處理 6小時(shí)后的幾種常見的癌癥相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，發(fā)現(xiàn)ATF4上調(diào)，并在時(shí)間上伴隨著磷酸化S6 ( phospho-S6 ) 水平的降低。加藥處理24 h內(nèi)，HTS細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，G1、G0與S期比值增加，3天后出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的分子特征。因此，Gboxin引起了原代GBM細(xì)胞的快速和特異性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，且對(duì)原代MEFs或星形膠質(zhì)細(xì)胞的中沒有表現(xiàn)明顯抑制生長的作用。

由于Gboxin持續(xù)給藥后，HTS細(xì)胞的膜電位降低，而MEFs細(xì)胞沒有。研究者進(jìn)行了耗氧量 ( Oxygen Consumption Rate, OCR ) 測量，發(fā)現(xiàn)了Gboxin對(duì)OCR的抑制作用呈濃度依賴性變化，與OXPHOS的抑制劑一樣有效。Gboxin對(duì)HTS細(xì)胞具有獨(dú)特的殺傷性，它對(duì)MEFs和星形膠質(zhì)細(xì)胞OCR耗竭會(huì)在30小時(shí)左右恢復(fù)；相反，OXPHO的抑制劑魚藤酮、抗霉素 A和寡霉素均可急性和慢性地抑制所有細(xì)胞的OCR。這些數(shù)據(jù)表明，Gboxin可能是通過破壞HTS細(xì)胞中的代謝來發(fā)揮抑制作用。

研究人員利用Gboxin類似物偶聯(lián)生物素 ( B-Gboxin, IC50 = 1530 nM ) 構(gòu)建了用于把靶標(biāo)識(shí)別的探針。質(zhì)譜分析Gboxin、B-Gboxin和兩者聯(lián)合使用處理HTS細(xì)胞的pull down樣品，確定Gboxin特異性相互作用的靶標(biāo)是處于線粒體的蛋白。在58種潛在的蛋白質(zhì)中，其中12種是OXPHOS機(jī)制的組成部分；來自所有OXPHOS復(fù)合物的成分都存在，其中以復(fù)合物V(拉下5個(gè)蛋白)最具代表性。他們使用復(fù)合物I、II、IV和V組分的特異性抗體進(jìn)行相互作用的確認(rèn)，與不同OXPHOS抑制劑對(duì)比發(fā)現(xiàn)，線粒體上的復(fù)合物V是Gboxin介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的功能靶標(biāo)。

利用Gboxin的光交聯(lián)類似物 ( C-Gboxin， IC50 = 350 nM ) 發(fā)現(xiàn)，HTS細(xì)胞線粒體中C-Gboxin含量較高。相反，對(duì)Gboxin不敏感的MEFs顯示C-Gboxin的線粒體積累有限，當(dāng)加入CsA后，會(huì)導(dǎo)致C-Gboxin的線粒體積累。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了前面的生化數(shù)據(jù)，表明Gboxin在腫瘤細(xì)胞線粒體中有特異性的積累，且是通過影響線粒體通透性來實(shí)現(xiàn)在線粒體的累積。

接下來，研究人員在三種獨(dú)立的原代小鼠GBM培養(yǎng)物和三種GBM患者源性培養(yǎng)物上都測試了Gboxin的活性。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)中所有的GBM細(xì)胞都對(duì)Gboxin的敏感，小鼠GBM細(xì)胞IC50更低，約為150nM，人類GBM細(xì)胞約為1μM。

他們還在常見的不同類型的人類腫瘤細(xì)胞系上檢測Gboxin的效果。與野生型的MEFs和星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Gboxin不敏感相比，大多數(shù)癌細(xì)胞系對(duì)gboxin敏感，并顯示出一定的治療效果。OCR檢測證實(shí)了細(xì)胞系中Gboxin 處理偶聯(lián)呼吸抑制。

為了更好的將Gboxin用于臨床前研究，研究人員優(yōu)化了其結(jié)構(gòu)，獲得了S-Gboxin ( IC50 = 470 nM ) ，具有良好的代謝穩(wěn)定性，優(yōu)異的血漿穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)特性，適用于體內(nèi)研究。在小鼠移植瘤模型上，HTS細(xì)胞移植后第3天或第14天開始給藥S-Gboxin 10 mg/kg /天來評(píng)估其體內(nèi)抗腫瘤活性。與對(duì)照組相比，使用S-Gboxin治療的小鼠腫瘤體積、細(xì)胞密度和增殖均有所減少，存活率有所提高。使用S-Gboxin治療的腫瘤降低了高級(jí)別膠質(zhì)瘤標(biāo)志物GFAP和OLIG2的表達(dá)。在基底膜基質(zhì)的存在下，原發(fā)人GBM細(xì)胞也被注射到免疫缺陷小鼠的側(cè)翼進(jìn)行病人樣本移植瘤模型的建立。在第3天檢測到可見腫瘤后，每日給予S-Gboxin，給予10mg/kg/天，與對(duì)照組相比，腫瘤細(xì)胞生長明顯減緩，細(xì)胞密度下降。

在原位瘤模型上，為了克服血腦屏障穿透性差的問題，使用導(dǎo)管輸送藥物來測試顱內(nèi)抗腫瘤活性。原代小鼠GBM細(xì)胞經(jīng)原位移植，然后進(jìn)行為期兩周的腫瘤接種期和術(shù)后恢復(fù)；在這之后，在注射部位植入導(dǎo)管，通過皮下微型泵原地輸送S-Gboxin（ 每只鼠每天2.16μg ）。S-Gboxin治療抑制腫瘤生長，表現(xiàn)為減少出血、細(xì)胞密度和增殖。組織病理學(xué)分析進(jìn)一步顯示高等級(jí)膠質(zhì)瘤標(biāo)志物表達(dá)降低。

研究人員還測試了兩個(gè)獨(dú)立的病人來源的異種移植 ( PDX ) 模型。從有癥狀的PDX小鼠P0身上收集新鮮的病人移植GBM，病人腫瘤1勻漿，病人腫瘤2分離成單細(xì)胞，原位植入到四只老鼠的腦中，每一只都沒有額外的操作，獲得P1。兩周 ( 患者腫瘤1 ) 或四周 ( 患者腫瘤2 ) 后，植入微型泵將安慰劑或S-Gboxin輸送到腫瘤區(qū)域。所有經(jīng)載藥治療的小鼠均表現(xiàn)出發(fā)病癥狀 ( 41-65天 ) ，并被殺進(jìn)行分析。S-Gboxin抑制GBM PDX的生長，表現(xiàn)為一般健康狀況，降低細(xì)胞密度，細(xì)胞增殖和GBM標(biāo)志物的表達(dá)。

盡管每天在體內(nèi)給藥超過四周或更長時(shí)間，但在使用S-Gboxin治療的小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)體重減輕或明顯的一般健康缺陷跡象。研究人員還檢查了S-Gboxin顱內(nèi)治療后腦室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞生境的狀況。對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示，給安慰劑和Gboxin小鼠的內(nèi)源性巢蛋白染色沒有異常，而治療后腫瘤內(nèi)的巢蛋白陽性細(xì)胞明顯減少。

從腫瘤樣本發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)先導(dǎo)化合物的篩選方法意味著發(fā)現(xiàn)的化合物可能更直接面向臨床需求，從提高藥理模型的“臨床效果可預(yù)測性”。本研究發(fā)展的高通量篩選方法不同于我們常規(guī)使用的體外系統(tǒng)或者模式細(xì)胞系統(tǒng)，是利用體內(nèi)瘤細(xì)胞來建立篩選，這個(gè)模型一方面更加近似于腫瘤發(fā)生的原生環(huán)境，另外這個(gè)模型還考慮到了潛在的腫瘤干細(xì)胞問題。

對(duì)于全新靶標(biāo)的First-in-class藥物發(fā)現(xiàn)而言，每一步都是前人未知的，雖然市場前景收益巨大，臨床前即使在小鼠模型上有優(yōu)異的效果，臨床II期在人體治療的結(jié)果才是真正的第一個(gè)考驗(yàn)。因此，利用更近似真實(shí)發(fā)病的藥理模型和人源化評(píng)價(jià)方法，將大大提高藥物在臨床II期的折損率，考慮到我國龐大的臨床資源，這將成為未來我國創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)中一大優(yōu)勢。