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生物醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)，互助你我。今天，我們給大家?guī)?lái)的是研究信號(hào)通路，常規(guī)實(shí)驗(yàn)WB，其常見(jiàn)問(wèn)題的分析。 1. 沒(méi)有足夠的一抗或二抗結(jié)合目標(biāo)蛋白 適當(dāng)?shù)奶岣呖贵w的稀釋比例，或者延長(zhǎng)4度孵育時(shí)間 2. 抗原量不足或者蛋白樣品降解 適當(dāng)?shù)奶岣呱蠘恿?，或者盡量使用新鮮的樣本組織。并且加入蛋白酶抑制劑 3. 轉(zhuǎn)膜不充分 使用可逆染色劑例如麗春紅S檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效果,檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF膜需預(yù)先浸在甲醇中，然后浸到轉(zhuǎn)移緩沖液中。 4. 過(guò)度封閉使目標(biāo)蛋白不能顯色 代替5% 脫脂奶粉，使用含0.5% 脫脂奶粉或無(wú)脫脂奶粉的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少封閉時(shí)間。 5.一抗不識(shí)別檢測(cè)物種的蛋白 參照說(shuō)明書(shū)，比對(duì)免疫原序列和蛋白序列以確?？贵w和目的蛋白會(huì)發(fā)生反應(yīng)，設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。 6. 組織中目的蛋白含量低 濃縮使信號(hào)最大化（例如檢測(cè)核蛋白要用核裂解物）。 7. 洗膜過(guò)度 勿過(guò)度洗膜 8. 二抗受疊氮鈉抑制 避免疊氮鈉和HRP標(biāo)記抗體一起使用。如果一抗中含有疊氮鈉，一抗完后洗膜充分 9. 檢測(cè)試劑盒過(guò)期和底物失活 使用新鮮的底物。 1. 未進(jìn)行非特異性封閉或封閉不充分：延長(zhǎng)封閉時(shí)間，考慮更換合適的封閉劑 2. 一抗?jié)舛冗^(guò)高：稀釋抗體至合適濃度，以更高稀釋度抗體孵育更長(zhǎng)時(shí)間（耗時(shí)長(zhǎng)但特異性結(jié)合最好）。 3.抗體孵育溫度過(guò)高：4°C孵育。 4.一抗或二抗與封閉劑有交叉反應(yīng)：在孵育和洗滌液中加入溫和去污劑如吐溫-20。脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，會(huì)結(jié)合磷酸化特異性抗體而易產(chǎn)生高背景。使用BSA代替奶粉作為封閉劑 5. 未結(jié)合蛋白質(zhì)洗滌不充分：增加洗滌次數(shù) 6. 膜的選擇導(dǎo)致的高背景：NC膜比PVDF膜背景低 7. 膜干燥：在孵育過(guò)程中防止膜變干，在任何步驟都保證膜有充分的反應(yīng)液，放入攪拌子不斷攪動(dòng)或輕輕振蕩使膜浸在溶液中，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。 1. 體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修飾形式如乙?；⒓谆?、烷基化、磷酸化、糖基化等：查閱文獻(xiàn)，使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來(lái)驗(yàn)證翻譯后的修飾。 2. 蛋白樣本降解（蛋白質(zhì)分子量降低）：在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑 3. 檢測(cè)到未經(jīng)報(bào)道過(guò)的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結(jié)構(gòu)不同的蛋白：查閱其它文獻(xiàn)報(bào)道，或BLAST搜尋，使用說(shuō)明書(shū)推薦的細(xì)胞株或組織。 4. 一抗?jié)舛冗^(guò)高，高濃度時(shí)常出現(xiàn)多條蛋白帶：降低抗體濃度和/或孵育時(shí)間。 5. 二抗?jié)舛冗^(guò)高，高濃度產(chǎn)生非特異性結(jié)合：降低抗體濃度，增加二抗對(duì)照（不加一抗） 6. 條帶為非特異性條帶：應(yīng)用封閉多肽來(lái)區(qū)分特異性和非特異性條帶，只有特異性條帶能被封閉從而消失。 7. 靶蛋白形成多聚體：SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10分鐘而不是5分鐘，使蛋白質(zhì)解聚。 |
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